HSV 病毒示蹤腰椎間盤突出癥模型大鼠中樞敏化的實驗研究*

徐 敏，周 壯，梁永輝

（1 海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，上海200433；2 蘇州大學附屬第二醫(yī)院疼痛科）

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)好發(fā)于30～50 歲人群，臨床表現(xiàn)包括腰痛、坐骨神經(jīng)痛和馬尾神經(jīng)痛等[1]。近年來大量研究表明，中樞腦區(qū)功能及結(jié)構(gòu)的適應性改變與疼痛調(diào)控過程相關[2]。本實驗以單純皰疹病毒(HSV)作為順行標記神經(jīng)環(huán)路的工具病毒，定位繪制自體髓核移植大鼠痛覺神經(jīng)傳導通路圖，并通過免疫熒光增強方法比較各核團標記細胞的差異，探索可能參與腰椎間盤突出癥源性疼痛中樞敏化的相關核團。

1 材料與方法

1.1 主要材料 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠102 只，6～8 周，體重180～220 g，由蘇州大學實驗動物中心提供(蘇SYXK2007-0035)。飼養(yǎng)于P2 實驗室，2 只一籠，室溫22 ℃，濕度50%～60%，通風良好，人工晝夜(12 h/12 h)。實驗大鼠分組:行為學實驗中LDH 組10 只，假手術(shù)組8 只；注射HSV 病毒實驗中注射病毒后1～7 d 每天1 組，共7 組，LDH 組和假手術(shù)組各6 只。HSV-1 H129(107 pfu/mL)(武漢樞密)，Triton×-100(Amresco 公司)，熒光抗淬滅劑(碧云天)，鼠抗GFP 多克隆抗體(Chemicon)，驢抗鼠免疫熒光抗體(Chemicon)，VFF(von Frey filaments，North Coast Medial Inc)，熱痛刺激儀，冰凍切片機(Leica)，OCT 冷凍包埋劑(櫻花公司)，正置熒光顯微鏡(ZEISS)。

1.2 方法

1.2.1 腰椎間盤突出癥模型建立:LDH 組大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后，剃毛、消毒，鋪設消毒巾。咬除L5、L6 左側(cè)椎板及關節(jié)突，顯露左側(cè)L5 和L6 神經(jīng)根及背根神經(jīng)節(jié)。將大鼠尾腹側(cè)近根部椎間盤髓核組織移植到L5 和L6 神經(jīng)根表面。假手術(shù)組僅作暴露神經(jīng)根及背根神經(jīng)節(jié)處理，從自體尾椎椎間盤采集髓核但不進行髓核移植。造模結(jié)束后立即將10 μL HSV 病毒平均分為5 份，從5個不同注射點注射到左側(cè)后掌足底。

1.2.2 壓力-縮腿閾及縮足反射潛伏期的測定、疲勞轉(zhuǎn)棒實驗:壓力-縮腿閾(paw withdrawal threshold，PWT)測定:用0.4～25 g 強度的von Frey 探針以升序測試刺激大鼠足墊中央位置，每次刺激≤4 s，每次間隔約10 s。大鼠被探針刺激后出現(xiàn)抬起后足或舔后足的行為為陽性反應，記錄出現(xiàn)陽性反應所需刺激強度。縮足反射潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)測定:按Hargreaves 法采用熱痛刺激儀照射大鼠足底，大鼠出現(xiàn)抬腿回避時為陽性反應，記錄出現(xiàn)陽性反應的時間。疲勞轉(zhuǎn)棒實驗(Rota rod 實驗):在測試前給予大鼠3 d 適應，采用20 r/min 轉(zhuǎn)速，記錄大鼠從轉(zhuǎn)棒跌落時間。

1.2.3 大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)、脊髓及大腦冰凍切片制備:術(shù)后1～7 d 隔日進行取材，大鼠麻醉后，暴露心臟，迅速灌入300 mL 預冷生理鹽水，待大鼠肝臟顏色發(fā)白、腸系膜血管血液消失后，采用多聚甲醛(pH 7.4)固定。依次鉗斷大鼠脊椎骨與顱骨，小心剝離DRG、脊髓及大腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定過夜。將固定的組織置于15%、30%蔗糖溶液中梯度脫水。包埋劑包埋組織，冰凍切片機切片，厚度30 μm。將切片貼在載玻片上晾干，儲存于-20 ℃冰箱中以備免疫熒光染色使用。

1.2.4 免疫熒光增強實驗:取材后1 d，腦部及脊髓處連續(xù)切片，每隔5 張取1 張進行免疫熒光染色，選取DRG 橫斷面較完整的切片進行免疫熒光染色。切片置于PBS 中沖洗3 次，每次5 min。室溫條件下用10%正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉2 h。一抗(鼠抗GFP 多克隆抗體)工作液孵育過夜，PBS 沖洗3 次，每次5 min。二抗(驢抗鼠免疫熒光抗體)工作液室溫下避光孵育1 h，PBS 沖洗3 次，每次5 min。避光條件下貼片，熒光抗淬滅劑封片保存。

1.2.5 圖像采集:使用正置熒光顯微鏡，參照大鼠腦立體定位圖譜對大鼠腦區(qū)HSV 感染陽性細胞核團定位。每個核團取其中間位置切片，計數(shù)陽性細胞數(shù)，并計算每組平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用OriginPro 8 統(tǒng)計學軟件(OriginLab，US)進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，組間比較行t 檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 自體尾椎髓核移植后大鼠同側(cè)下肢痛覺閾值及運動功能變化 LDH 組大鼠自體髓核移植術(shù)后機械痛閾值及熱痛閾值顯著降低，術(shù)后第7 d 痛閾值最低，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖1A、1B)。LDH 大鼠術(shù)前、術(shù)后在Rotarod 上的時間無顯著改變，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖2)，說明自體尾椎髓核移植對大鼠運動功能無明顯影響。

圖1 自體尾椎髓核移植后大鼠同側(cè)下肢痛閾值變化

圖2 Rotarod 實驗測試自體尾椎髓核移植大鼠運動功能

2.2 HSV 病毒在LDH 組大鼠DRG 及脊髓的分布情況 少許L4～L5 DRG 神經(jīng)元細胞被HSV 病毒(綠色)及DAPI(藍色)共標，顯示神經(jīng)元細胞內(nèi)感染了HSV 病毒(圖3A-C，封二)。L4～L5 DRG 中HSV病毒標記的神經(jīng)元細胞數(shù)量顯著增多，部分神經(jīng)纖維也被HSV 病毒標記(圖3D，封二)。在注射病毒后3 d，L5～L6、L4～L5 同側(cè)脊神經(jīng)DRG 內(nèi)均發(fā)現(xiàn)陽性細胞的標記，隨著存活時間延長，陽性細胞數(shù)量顯著增加，第7 d 陽性細胞數(shù)為最多。第3～4 d 脊髓開始出現(xiàn)陽性細胞標記，L5～L6、L4～L5 脊髓節(jié)段灰質(zhì)區(qū)域同側(cè)脊髓背角分布最為集中，與感染的DRG 相對應。頸段脊髓白質(zhì)腹側(cè)區(qū)也出現(xiàn)少許病毒標記的陽性神經(jīng)元。見圖4(封二)。

圖3 HSV 病毒在DRG 中的分布圖

圖4 HSV 病毒在脊髓中的分布

2.3 HSV 病毒在LDH 組大鼠延髓及腦橋的分布情況 大鼠注射HSV 病毒后第5 d 腦干延髓段矢狀面顯示，HSV 病毒標記的陽性細胞沿著尾端腹外側(cè)核(CVL)、網(wǎng)狀小細胞核(PCRt)到微孔背蓋核(MiTg)呈軸狀分布(圖5A，封三)。同時雙側(cè)藍斑區(qū)(LC)出現(xiàn)聚集的陽性細胞，LC 下側(cè)的藍斑下核背側(cè)區(qū)(SubCD)、藍斑下核腹側(cè)區(qū)(SubCV)、面神經(jīng)(7N)也出現(xiàn)較多陽性細胞(圖5，封三)。HSV 注射4 d 后出現(xiàn)腦干陽性標記細胞，分布于雙側(cè)多個核團。延髓段以頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)(RVM)最為集中，呈“個”字型分布，包括尾端腹外側(cè)核(GiA)、網(wǎng)狀小細胞核(Rmg)及旁巨細胞核(LPGi)，背側(cè)的背巨細胞核(DPGi)也有少許散在分布的陽性細胞(圖6，封三)。其次是腦橋中藍斑區(qū)域陽性細胞分布較為集中(圖5D，封三)。大鼠注射HSV 病毒后第5 d 中縫核喙(Rli)橫斷面顯示，HSV 病毒標記的陽性細胞聚集在Rli，其他區(qū)域未發(fā)現(xiàn)陽性細胞，提示緊接著RVM 后Rli 出現(xiàn)陽性神經(jīng)元聚集(圖7，封三)。

圖5 HSV 病毒在延髓段的分布

圖6 HSV 病毒在延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)的分布

圖7 HSV 病毒在中縫核喙的分布

2.4 HSV 病毒在LDH 組大鼠中腦區(qū)域的標記情況 中腦導水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)(vlPAG)出現(xiàn)標記的陽性細胞較LC 及Rli 延遲約1 d，這些雙側(cè)對稱分布于導水管腹外側(cè)的陽性神經(jīng)元彼此間距較大，但有廣泛的突觸聯(lián)系(圖8，封三)。陽性細胞分布與導水管在縱軸上平行較長一段距離(Bregma-8.4 mm～Bregma -6.8 mm)。

圖8 HSV 病毒在中腦導水管腹外側(cè)區(qū)的分布

2.5 HSV 病毒在LDH 組大鼠前腦區(qū)域中的標記情況 HSV 病毒注射后第6 d 前腦部分雙側(cè)室旁核(PVN)出現(xiàn)較多被標記的陽性細胞，細胞之間廣泛聯(lián)系，交織成網(wǎng)呈倒三角形分布(圖9，封三)。病毒注射后第7 d 雙側(cè)初級感覺皮層后肢代表區(qū)(S1HL)出現(xiàn)較多被標記的陽性細胞，并呈放射狀分布，神經(jīng)元的胞體及樹突的輪廓清晰可見(圖10，封三)。

圖9 HSV 病毒在室旁核的分布

圖10 HSV 病毒在初級感覺皮層后肢代表區(qū)的分布

3 討論

近年來腰椎間盤突出癥的下腰痛和坐骨神經(jīng)痛引起越來越多的關注，部分患者僅為輕微椎間盤退變，但仍存在慢性腰腿痛或疼痛復發(fā)，藥物治療效果不佳。功能磁共振成像技術(shù)(fMRI)證實，腦內(nèi)存在多個疼痛相關區(qū)域[3]。HSV-1 H129 具有特異順向跨多級突觸的特性[4]，本研究使用HSV 順行跨多突觸示蹤技術(shù)和免疫熒光增強方法來確定LDH 大鼠中樞敏化路徑及特異性核團。自體尾椎髓核移植大鼠作為LDH 疼痛模型，結(jié)果顯示LDH 組大鼠機械痛閾值與熱痛閾值下降，并都在術(shù)后第7 d 閾值最低。預實驗結(jié)果顯示，足底注射HSV 病毒1 周左右感染至整個腦區(qū)，因此在術(shù)后立即注射HSV 病毒。

HSV 注射3 d 后，DRG 中陽性神經(jīng)元主要集中于同側(cè)L4～L5 及L5～L6 節(jié)段。我們先前的研究已經(jīng)證實DRG 參與LDH 源性疼痛的調(diào)控[5]。DRG 作為感覺傳入的第一級神經(jīng)元，匯集了軀體初級感覺神經(jīng)元，在痛覺的感知、調(diào)控和傳遞過程中起著至關重要的作用。

脊髓內(nèi)腰膨大處脊髓背角是標記細胞最早最集中的區(qū)域，HSV 注射后第4 d 該處神經(jīng)元較為均一，但隨著時間延長，標記細胞數(shù)量顯著上升，其形態(tài)也出現(xiàn)明顯差異，提示此區(qū)域可能存在不同類型的神經(jīng)元。脊髓背角是感覺信息傳入與整合的初級中樞。神經(jīng)受損傷性刺激時, 初級傳入神經(jīng)元過度興奮，進而引起脊髓背角神經(jīng)元的興奮，該層的突觸聯(lián)系發(fā)生功能性或器質(zhì)性改變，從而產(chǎn)生中樞敏化[6]。

腦干內(nèi)多個相關核團的標記出現(xiàn)在脊髓之后，LC 及A7 區(qū)神經(jīng)元向脊髓的投射局限于脊髓后角和前角，而不朝IML，所以它們的標記可能主要來自脊髓后角。延髓段RVM 是腦干內(nèi)標記最為顯著的部位，相對于腦內(nèi)其他區(qū)域，該處標記尤為集中。早期研究指出，RVM 介導的下行易化系統(tǒng)參與慢性痛的中樞敏化機制[7]。LC 是其次出現(xiàn)較多集中陽性神經(jīng)元的區(qū)域，先前研究證實此區(qū)域存在腎上腺素能藍斑-脊髓系統(tǒng)在下行疼痛調(diào)控中的突觸機制[8]。RLi緊接RVM 之后出現(xiàn)陽性細胞集中，但數(shù)量較少。

中腦區(qū)vlPAG 標記出現(xiàn)在RVM 及LC 之后，這些神經(jīng)元彼此間的突觸交織分布成網(wǎng)，聯(lián)系十分緊密，且標記陽性細胞在縱軸方向上分布較廣泛。多位學者證實，vlPAG 參與神經(jīng)病理性疼痛、偏頭疼等多種痛覺感受的處理與調(diào)節(jié)[9]，提示該區(qū)域是LDH 源性疼痛的重要調(diào)控中樞及傳遞樞紐。有研究證實存在Rli 與vlPAG 的解剖聯(lián)系[10]，本實驗對此作了進一步驗證。vlPAG-RVM 軸在中樞敏化中起著重要作用，周圍神經(jīng)損傷對初級傳入纖維持續(xù)刺激，RVM神經(jīng)元的表型發(fā)生變化，啟動神經(jīng)元(on-cell)活性增加，但停止神經(jīng)元(off-cell)短暫性抑制[11]。另外，RVM 星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化和增殖，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)釋放，p38 MAPK 磷酸化，膽囊收縮素(CCK)及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位的表達上調(diào)，均對中樞敏化的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[12]。

雙側(cè)室旁核(PVN)于注射病毒后第6 天出現(xiàn)大量陽性神經(jīng)元，與vlPAG 一樣彼此間突觸交織分布成網(wǎng)，聯(lián)系十分緊密。有研究表明，新生期母嬰分離模型通過影響PVN 和前皮質(zhì)扣帶回中Fos 蛋白表達，造成幼鼠內(nèi)臟的高敏狀態(tài)[13]。另有實驗證明，電極刺激大鼠PVN 可以影響大鼠痛覺閾值[14]。本研究LDH 組中對側(cè)PVN 區(qū)域出現(xiàn)更多的陽性細胞，與同側(cè)的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而假手術(shù)組中對側(cè)PVN 陽性細胞數(shù)較同側(cè)稍多，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明PVN 區(qū)域特異性調(diào)控LDH 源性疼痛。由于患側(cè)的慢性痛長期刺激導致高級中樞的痛覺信號匯集，致使次區(qū)域神經(jīng)元免疫性下降，HSV更易集中。

HSV 注射后第7 天，雙側(cè)初級感覺皮層后肢代表區(qū)(S1HL)出現(xiàn)較多陽性神經(jīng)元，呈扇形分散分布，單個神經(jīng)元的軸突樹突清晰可見。近年有研究證實，廣泛的皮層區(qū)域參與痛覺的處理過程，并在痛覺生成和調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[15]?；隗w素的形態(tài)學分析(VBM)發(fā)現(xiàn)，慢性腰背痛患者在軀體感覺皮層和腦干中的灰質(zhì)體積減少，而在左側(cè)丘腦與雙側(cè)基底節(jié)中灰質(zhì)體積增加[16]。S1HL 主要控制后肢感覺代表區(qū)域，此處出現(xiàn)較多陽性神經(jīng)元進一步證實這條足底感覺至相關感覺皮層的通路。同樣，LDH 組對側(cè)S1HL 區(qū)域較同側(cè)出現(xiàn)更多的陽性神經(jīng)元，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而假手術(shù)組兩側(cè)的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，進一步說明LDH 源性疼痛在此區(qū)域存在更高的特異性和相關性，S1HL 可能是調(diào)控腰椎間盤源性疼痛中樞敏化的終極中樞。

綜上所述，本研究應用HSV 神經(jīng)示蹤技術(shù)可靠顯示了腰椎間盤突出癥中樞敏化的路徑，即SCDRG-DH-(RVM—Rli)/LC-vlPAG-PVN-S1HL 路徑，對側(cè)PVN 與S1HL 在LDH 中樞敏化的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮特殊作用，為足底感覺傳遞提供了神經(jīng)解剖學基礎，從而為進一步研究高位中樞對腰椎間盤突出癥中樞敏化的機制提供線索。