陜西西安蛋雞禽肝炎脾大綜合征HEV基因3型病毒分離與鑒定

張靖飛，張 園2，張靖維3，馮 鵬，石龍飛，王 新

(1.西安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710061；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.青海省都蘭縣畜牧獸醫(yī)站)

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)可引起雞大肝大脾病、肝炎脾大綜合征和產(chǎn)蛋率下降，危害全世界養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。該病會(huì)導(dǎo)致蛋雞和肉種雞的死淘率升高(1 %～4 %)、產(chǎn)蛋率下降(20 %～40 %)以及種蛋孵化率降低(10 %～30 %)。此外，禽HEV感染會(huì)使雞群處于亞健康狀態(tài)，當(dāng)氣候和飼料等外界環(huán)境改變或與其它病原混合感染時(shí)，極有可能導(dǎo)致雞群爆發(fā)雞大肝大脾病、肝炎脾大綜合征和產(chǎn)蛋率下降。目前，該病毒感染在許多國(guó)家或地區(qū)的雞群中均有報(bào)道。

1997年，楊德吉等首先通過血清學(xué)證實(shí)了禽HEV感染存在于我國(guó)雞群中。2010年，我國(guó)第一株禽HEV被分離鑒定。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，禽HEV感染是我國(guó)雞群暴發(fā)肝脾腫大的主要病因。近年來(lái)，禽HEV與其它病原混合感染導(dǎo)致的肝破裂出血綜合征也給我國(guó)蛋雞和種雞養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2014～2015年，陜西省部分蛋雞場(chǎng)爆發(fā)了禽HEV感染引起的產(chǎn)蛋率下降的疫情，給養(yǎng)雞場(chǎng)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨后，通過改善雞場(chǎng)的生物安防，部分疫情得到了有效控制。

2019年7月，陜西西安市某蛋雞場(chǎng)(存欄量為32 000只)的一棟雞舍(海蘭褐商品蛋雞7 500只)，雞只在42周齡時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降，47周齡時(shí)產(chǎn)蛋率下降達(dá)到最大(30 %)，死淘率升高5 %左右。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)部分死亡雞只肝臟出血、腫大和壞死(圖1)。依據(jù)臨床表現(xiàn)和剖檢病變，初步懷疑該疫情可能是由禽HEV感染引起的雞大肝大脾病。為了進(jìn)一步確診，本研究從發(fā)病的蛋雞場(chǎng)采集了36份血清、13份膽汁以及糞便、肝臟和脾臟各11份，然后利用間接ELISA和巢式RT-PCR分別對(duì)血清中的抗禽HEV抗體和糞便等病料中的禽HEV RNA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

圖1 部分死亡及時(shí)剖檢后出現(xiàn)肝臟腫大和壞死

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 總RNA提取試劑RNAiso Plus和T載體連接試劑盒pMD18-T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Transcript反轉(zhuǎn)錄酶，Transtaq High Fidelity DNA聚合酶，EasyPure Quick Gel Extraction試劑盒等常規(guī)分子生物學(xué)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其它常規(guī)的有機(jī)和無(wú)機(jī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 樣品的來(lái)源 從發(fā)病雞舍中隨機(jī)挑選32只雞，翅靜脈采集血液(32份)；剖檢死亡雞13只，取剖檢雞只的膽汁(13份)，糞便(11份)，肝臟(11份)和脾臟(11份)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理 將采集的血液樣品首先37 ℃放置 1 h，4 ℃過夜后，3 000 r/min離心10 min，析出血清用于禽HEV抗體檢測(cè)。將采集的糞便和膽汁樣品首先用無(wú)菌0.1 M PBS(pH=7.2)按照質(zhì)量體積比制成10 %懸浮液，然后3 500 r/min離心10 min，上清液用于禽HEV RNA的檢測(cè)。采集的肝臟和脾臟樣品首先用組織研磨機(jī)研磨后，反復(fù)凍融3次，3 500 r/min離心10 min，取上清用于禽HEV RNA的檢測(cè)。

1.2.2 血清中抗禽HEV抗體檢測(cè) 間接ELISA檢測(cè)采集的雞血清中抗禽HEV抗體，以原核表達(dá)純化的截短的禽HEV ORF2蛋白為包被抗原，2.5 %的脫脂奶粉封閉，利用洗滌液將雞血清樣品按1∶50稀釋，室溫孵育1 h后，加入100μL 1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗，最后加入TMB顯色，濃硫酸終止反應(yīng)后，自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。

1.2.3 糞便、膽汁、肝臟和脾臟中禽HEV的RNA檢測(cè) 參考Sun等的方法，進(jìn)行樣品中禽HEV RNA的檢測(cè)。首先合成擴(kuò)增禽HEV ORF2基因的部分序列的巢式PCR引物，外側(cè)引物為ORF2/F-1/SD：5'-TCGCCT(C)GGTAAT(C)ACA(T)AATGC-3'，ORF2/R-1/SD：5'-GCGTTC(G)CCG(C)ACAGGT(C)CGGCC-3'；內(nèi)側(cè)引物為ORF2/F-2/SD：5'-ACA(T)AATGCT(C)AGGGTCACCCG-3'，ORF2/R-2/SD：5'-ATGTACTGA(G)CCA(G)CTG(C)GCCGC-3'，其擴(kuò)增的目的片段的大小分別為278 bp和242 bp。按照RNAiso Plus試劑的操作說(shuō)明書，取200 μL已處理的糞便、膽汁，肝臟和脾臟的上清液進(jìn)行總RNA的提取。然后以提取的RNA為模板，按照Transcript反轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明書，以oligo dT為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA。以cDNA為模板，按照Transtaq High Fidelity DNA聚合酶說(shuō)明書進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。最后，取5 μL第二輪PCR產(chǎn)物于0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.4 禽HEV ORF2基因部分序列的測(cè)定與分析 按照EasyPureQuickGelExtraction試劑盒的說(shuō)明書對(duì)擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行TA連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

利用DNA Star軟件將測(cè)序獲得序列與GenBank上禽HEV的參考序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化樹分析。所用參考序列的GenBank登錄號(hào)為KP221201、GQ398042、AY870827、FM872317、FM872312、AY870829、EU919193及FM872314。

2 結(jié)果

2.1 禽HEV抗體檢測(cè)結(jié)果

依據(jù)建立的禽HEV抗體間接ELISA檢測(cè)方法陰性和陽(yáng)性血清的判定值(OD 450 nm>0.298為陽(yáng)性，反之為陰性)判定值0.298，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的32份雞血清中28份為抗禽HEV抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為87.5 %，其中6份雞血清的OD 450 nm>1.0(圖2)。

圖2 間接ELISA檢測(cè)32份雞血清中抗禽HEV抗體結(jié)果

2.2 禽HEV的RNA檢測(cè)結(jié)果

利用巢式PCR檢測(cè)肝臟，脾臟，膽汁和糞便共46份樣品中禽HEV核酸，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，11份肝臟組織樣品中，5份出現(xiàn)的242 bp的目的條帶；11份脾臟樣品中，3份為陽(yáng)性；13份膽汁樣品中，6份為陽(yáng)性；11份糞便樣品中，3份為陽(yáng)性(圖3)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，膽汁樣品中陽(yáng)性率為46.15 %，檢出率最高；肝臟樣品中陽(yáng)性率為45.45 %，檢出率次之；糞便和脾臟樣品中陽(yáng)性率均為27.27 %(表1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 15 000；1-11：肝臟樣品；12-22：脾臟樣品；23-35：膽汁樣品；36-46：糞便樣品

表1 不同樣品禽HEV核酸檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 序列分析

將獲得的17份陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物膠回收與pMD18-T載體連接后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)所獲得17個(gè)序列相互之間的同源性為99 %～100 %，為同一禽HEV分離株，將該分離株命名為SX-XA-1。將該序列與GenBank上已知的禽HEV序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，其與中國(guó)其它地區(qū)的禽HEV分離株的同源在在93 %～96 %之間，與基因3型分離株的同源性在93 %～97 %之間，與基因1型分離株同源性在80 %～83 %，2型為77 %～80 %，4型為81 %～86 %(表2)。

表2 擴(kuò)增獲得的禽HEV ORF2部分基因序列與國(guó)內(nèi)其它地區(qū)以及其它基因型分離株的同源性比較分析

利用DNA Star軟件包里的Clustal W 程序構(gòu)建不同禽HEV分離株的進(jìn)化樹，結(jié)果顯示本研究分離的陜西西安禽HEV分離株SX-XA-1與我國(guó)其他省份地區(qū)及歐洲和美國(guó)部分分離株在同一進(jìn)化分支上，同屬于禽HEV基因3型(圖4)。

圖4 不同禽HEV分離株ORF2部分基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

3 討論

禽HEV感染一方面僅引起雞只的亞臨床感染，但當(dāng)外界因素(環(huán)境、飼料等)改變或與其它病原混合感染時(shí)會(huì)引起雞只發(fā)病；另一方面高劑量禽HEV單獨(dú)感染也可引起蛋雞的產(chǎn)蛋率下降。本次疫情發(fā)病的雞場(chǎng)已斷斷續(xù)續(xù)持續(xù)發(fā)病2個(gè)月，雞只在47周齡時(shí)產(chǎn)蛋量下降率達(dá)到最大約30 %，同時(shí)伴隨雞只死淘率上升(5 %左右)，通過抗生素治療，發(fā)現(xiàn)效果不佳。對(duì)病死雞剖檢后發(fā)現(xiàn)部分雞只出現(xiàn)肝臟腫大、出血。依據(jù)臨床表現(xiàn)和剖檢病變，初步懷疑為禽HEV感染導(dǎo)致。隨后我們對(duì)發(fā)病雞進(jìn)行血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，間接ELISA抗體和巢式PCR 檢測(cè)結(jié)果證實(shí)該雞場(chǎng)存在禽HEV感染。但是，臨床上禽HEV單獨(dú)感染通常僅會(huì)引起雞只的亞臨床感染，因此，我們推測(cè)該疫情可能還有其他因素共同參與導(dǎo)致的，通過對(duì)雞場(chǎng)的問詢和飼料使用情況調(diào)查后，此次疫情診斷為由禽HEV感染和飼料(霉變)改變共同引起的。

由于禽HEV體外培養(yǎng)體系的缺乏，目前對(duì)該病的診斷主要通過血清中抗體檢測(cè)和組織樣品中的禽HEV RNA檢測(cè)。其中抗體檢測(cè)主要是通過原核表達(dá)純化的禽HEV ORF2蛋白為包被抗原的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，目前已有基因2型和3型禽HEV衣殼蛋白包被抗原的間接ELISA方法被報(bào)道，并且被廣泛應(yīng)用于血清中禽HEV抗體的檢測(cè)。而禽HEV的RNA檢測(cè)，主要是通過針對(duì)禽HEV ORF1和ORF2基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)，目前針對(duì)ORF2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物被廣泛使用。本研究通過已建立的禽HEV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法證實(shí)雞群中存在禽HEV抗體，其次通過針對(duì)擴(kuò)增ORF2基因的巢式RT-PCR方法證實(shí)了死亡雞只中存在禽HEV核酸，血清學(xué)和病原學(xué)共同證實(shí)了禽HEV感染在該雞場(chǎng)中的存在。

禽HEV感染和禽白血病等疾病臨床癥狀表現(xiàn)相似，但是可以通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行鑒別診斷。本次疫情剖檢雞只肝臟腫大，但未出現(xiàn)大小不一的結(jié)節(jié)狀或塊狀腫瘤，同時(shí)對(duì)雞場(chǎng)馬立克，J亞群禽白血病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果也均為陰性；此外對(duì)肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離，也未分到任何致病性細(xì)菌。因此，綜合上述檢測(cè)結(jié)果，該疫情排除了其它疾病感染的可能性。

目前認(rèn)為糞-口途徑的水平傳播是禽HEV的主要傳播途徑。目前尚無(wú)針對(duì)該病的特效疫苗和治療藥物。該病的防控主要是通過檢測(cè)雞只，淘汰禽HEV核酸陽(yáng)性雞只，然后及時(shí)進(jìn)行雞舍的消毒，并對(duì)雞糞進(jìn)行及時(shí)處理，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全防控措施，減少雞群應(yīng)激，增強(qiáng)雞群抵抗力，從而防控該病在雞群中的持續(xù)發(fā)生。