木質(zhì)素與蚯蚓對黑麥草生物量及土壤微生物群落的影響①

孫 月，潘彥碩，曾 軍，吳宇澄*，林先貴

(1 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

木質(zhì)素是構(gòu)成植物木質(zhì)部的復(fù)雜高分子化合物，是僅次于纖維素的第二大豐富的植物源材料。作為一種復(fù)雜的交叉連接的多酚聚合物，木質(zhì)素主要由3種類型的對羥基苯基丙基醇(單體醇)組成，即松柏醇(愈創(chuàng)木基型)、芥子醇(紫丁香基型)和香豆素醇(對羥基苯基型)。木質(zhì)素應(yīng)用廣泛，可作環(huán)氧樹脂、橡膠及熱塑性塑料等的添加劑、高分子原料、動物飼料添加劑以及土壤的改良劑和修復(fù)劑。研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素能夠提高土壤有效磷含量，促進無機磷向有機磷的轉(zhuǎn)化，提高磷肥利用率[1]。木質(zhì)素還可以作為共代謝底物刺激土壤微生物促進多環(huán)芳烴的降解[2]。在土壤中，木質(zhì)素的降解依賴于微生物作用。一般認(rèn)為，真菌首先解聚木質(zhì)素，所產(chǎn)生的酚酸類單體化合物經(jīng)由細菌進行礦化[3]。酚酸類物質(zhì)屬于自毒物質(zhì)，可能產(chǎn)生植物化感作用，抑制植物生長[4]。

蚯蚓是常見的土壤動物，被譽為土壤生態(tài)系統(tǒng)的“工程師”，在有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)、土壤理化性質(zhì)的改良、土壤微生態(tài)平衡等方面均有促進作用。許多研究表明蚯蚓能緩解植物生長障礙。例如，蚯蚓能促進酚類物質(zhì)的降解，抑制化感作用，改善草莓的連作障礙，這種調(diào)控主要通過微生物實現(xiàn)[5]；蚯蚓分泌的黏液能促進土壤污染物的去除，同時促進黑麥草生長[6]；蚯蚓還可以與菌根真菌互作，改善植物營養(yǎng)和生長，并協(xié)同修復(fù)土壤重金屬[7]。

黑麥草(Lolium perenneL.)，屬禾本科黑麥屬，是一種優(yōu)質(zhì)的飼草，也常用于污染農(nóng)田土壤的修復(fù)。前期研究表明，木質(zhì)素對黑麥草的生長有抑制作用[2]，不利于其實際應(yīng)用。為解決這一問題，有必要利用包括投加蚯蚓在內(nèi)的各種手段，緩解黑麥草生長障礙，而木質(zhì)素和蚯蚓對土壤生態(tài)系統(tǒng)的作用，也將在土壤微生物群落響應(yīng)中得到反映。為此，本研究設(shè)立了盆栽試驗，以黑麥草為模式植物，研究木質(zhì)素、蚯蚓及其聯(lián)合作用對植物生物量的影響，并通過qPCR和高通量測序深入解析木質(zhì)素、蚯蚓及其聯(lián)合作用對土壤微生物豐度、群落組成的影響，以揭示蚯蚓緩解木質(zhì)素對植物生長脅迫的作用及其對相關(guān)土壤微生物群落的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：采自江蘇省南京市某鋼鐵廠附近的農(nóng)田表層土壤。土樣放置室內(nèi)自然風(fēng)干，過2 mm篩。土壤的基本理化性質(zhì)為：pH 6.84，有機質(zhì)12.7 g/kg，全氮1.3 g/kg，全磷0.57 g/kg，全鉀19.3 g/kg。

供試植物：黑麥草(Lolium perenneL.)，種子購于江蘇省南京市玄武區(qū)東郊種業(yè)公司。

供試蚯蚓：威廉環(huán)毛蚓(Pheretima guillelmi)，購于江蘇省句容市某蚯蚓養(yǎng)殖場。

化學(xué)試劑：木質(zhì)素購于Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

盆栽試驗于中國科學(xué)院南京土壤研究所玻璃溫室內(nèi)進行，設(shè)置4個處理，見表1，每個處理4個重復(fù)。試驗采用底部有孔的塑料盆，便于水分瀝出，盆下放置托盤，收集瀝出的水分。加入土壤之前，將孔徑1 mm的尼龍網(wǎng)鋪在盆底，以防蚯蚓游出。每盆包含2 kg土壤，木質(zhì)素加入量為8 g/kg，充分混勻后加入盆中，加水調(diào)節(jié)土壤含水量至田間持水量的60%。加入威廉環(huán)毛蚓6條/盆，未鉆入土壤的用其他蚯蚓取代，保證每條蚯蚓健壯。黑麥草種子用溫水浸種24 h，經(jīng)催芽后分別穴播于上述盆缽中，每盆20粒。出苗1周后間苗，每盆留苗10株。溫室培育3個月后收集植物樣品和土壤樣品。每盆用不銹鋼土鉆隨機取5個點土樣混合，并將土樣置于–20℃保存以供微生物分析。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatment

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植物生物量測定 植物生物量采用常壓恒溫干燥法測定[8]。

1.3.2 土壤DNA的提取 采用FastDNA Spin Kit for soil 試劑盒(MP Biomedicals, Solon, USA)提取土壤DNA，每個樣品約0.5 g，微量分光光度計(NanoDrop 2000)和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的濃度和質(zhì)量。DNA經(jīng)10倍稀釋后用于下游分析，以防共提取雜質(zhì)的干擾。

1.3.3 定量PCR 采用定量PCR方法測定土壤中細菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因的數(shù)量。引物分別是515F/907R[9-10]、nu-SSU-0817-5’/nu-SSU-1196-3’[11]。定量PCR采用SYBR Green方法，每個樣品重復(fù)3次?？寺∧繕?biāo)基因提取質(zhì)粒后，測定其濃度并計算拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品，進行梯度稀釋、測定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(拷貝數(shù)范圍102~ 108copies/μl)，細菌16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.997，擴增效率117%，真菌18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.995，擴增效率99%。

1.3.4 高通量測序及數(shù)據(jù)分析 采用通用引物515F/907R擴增細菌16S rRNA 基因片段，ITS1f/ITS2[12]擴增真菌ITS基因，其中正向引物序列中包含 5 bp 的條形碼(barcode)序列。將PCR擴增后的產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后建立文庫，采用 Illumina MiSeq 系統(tǒng)進行雙向高通量測序(上海美吉)?；赒IIME2分析平臺進行高通量數(shù)據(jù)分析。序列經(jīng)拼接、比對后在 97% 相似性水平劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，通過與 Silva數(shù)據(jù)庫(https://www.arb-silva.de/)比較確定細菌序列的系統(tǒng)學(xué)分類，通過與Unite數(shù)據(jù)庫(http://unite.ut.ee/)比對確定真菌序列的系統(tǒng)學(xué)分類。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進行單因素方差分析(ANOVA)，用R Studio的vegan包計算布雷距離(bray distance)進行非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)，采用pheatmap包(https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap)進行熱圖分析，用Graphpad Prism 5分析作圖，圖中數(shù)據(jù)均為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑麥草生物量

經(jīng)過3個月的溫室培養(yǎng)，各處理黑麥草的生物量如圖1所示。R處理黑麥草的生物量平均為3.91 g/盆；添加木質(zhì)素(RL處理)對黑麥草生長的抑制作用明顯，植物生物量平均為2.32 g/盆，抑制率為41%；添加蚯蚓(RE處理)顯著促進黑麥草的生物量，平均達8.70 g/盆；RLE處理中，蚯蚓部分解除了木質(zhì)素的抑制作用，植物生物量平均達到6.22 g/盆，顯著高于R處理。

2.2 基因豐度

定量PCR測定結(jié)果(圖2)顯示，4個處理細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)在1.21×109~ 2.93×109copies/g。其中R處理細菌16S rRNA基因豐度為2.11×109copies/g，RL處理明顯降低了細菌的基因拷貝數(shù)，RE與R處理的基因拷貝數(shù)基本相同，表明單一蚯蚓處理對土壤細菌豐度沒有產(chǎn)生顯著效應(yīng)；RLE處理與RL處理相比，土壤細菌基因拷貝數(shù)顯著增加，達到2.93×109copies/g，是RL處理的2倍。

從圖2還可知，4個處理真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1.64×106~ 1.11×107copies/g，趨勢和細菌基本保持一致。木質(zhì)素明顯降低了真菌的基因拷貝數(shù)，而蚯蚓增加了真菌的基因拷貝數(shù)，從R處理的6.36×106copies/g增加至RE處理的9.04×106copies/g。木質(zhì)素、蚯蚓共存下真菌18S rRNA基因豐度的增幅更加明顯，RLE處理的基因拷貝數(shù)是RL處理的6倍之多。

2.3 細菌群落

在細菌16S rRNA基因的高通量測序中，RL處理4個重復(fù)中有1個未能成功擴增，其余15個樣品共獲得43萬條序列，單個樣品的序列數(shù)在9 309 ~43 850，在97% 序列相似性水平獲得9 277個OTU。每個樣品隨機抽樣9 000條序列做OTU 表，在此基礎(chǔ)上對土壤細菌群落組成進行分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過3個月的溫室培養(yǎng)，各處理的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了顯著變化(圖3A)。R與RE處理聚集在一起，RL與RLE處理聚集在一起，表明木質(zhì)素對細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較大的影響，而蚯蚓對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響相對較小。

對相對豐度大于2% 的細菌門進行分析(圖4A)，結(jié)果顯示，在R處理中，土壤中的優(yōu)勢細菌為γ-變形 菌 門(Gamma Proteobacteria)、擬 桿 菌 門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、α-變形菌門(Alpha Proteobacteria)，分別占比32.00%、17.09%、16.31%、9.45%；與R處理相比，添加木質(zhì)素明顯改變了細菌門水平的組成，促進了α-變形菌門、δ-變形菌門(Delta Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度，降低了γ-變形菌門(Gamma Proteobacteria)、酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度；而添加蚯蚓主要促進了α-變形菌門、酸桿菌門和藍藻門(Cyanobacteria)的相對豐度，降低了擬桿菌門的相對豐度；RLE處理與RL處理相比，γ-變形菌門、酸桿菌門的相對豐度有一定的升高，厚壁菌門的相對豐度有一定的降低。

為探究各處理的作用特征，在科水平對相對豐度大于1%，且處理間具有顯著性差異的細菌做熱圖分析(圖5)。根據(jù)細菌對木質(zhì)素的響應(yīng)，R與RE、RL與RLE處理分別聚為一類，比較可見，蚯蚓對細菌的影響不大，主要顯著富集了酸桿菌的Blastocatellaceae、Pyrinomonadaceae和變形菌的Caulobacteraceae、Rhizobiaceae、Burkholderiaceae等。木質(zhì)素導(dǎo)致多個科，如擬桿菌中的Lentimicrobiaceae、Prolixibacteraceae、Bacteroidetes vadinHA17，酸桿菌中的Koribacteraceae，變形菌中的Sphingomonadaceae、Methylophilaceae、Archangiaceae、Geobacteraceae，厚壁菌中的Christensenellaceae等豐度顯著增加。

進一步分析各處理中相對富集程度較高的類群，結(jié)果如圖6所示。Ignavibacteriales/Other、Lentimicrobiaceae、Methylophilaceae、Prolixibacteraceae、Christensenellaceae、Bacteroidetes vadinHA17、Koribacteraceae、Sphingomonadaceae、Archangiaceae和Anaerolineaceae在R、RE處理中的相對豐度極低，在RL處理中均有較高的相對豐度，而在RLE處理中的相對豐度雖低于其在RL處理中的相對豐度，但大多高于僅加入蚯蚓的RE處理，仍然顯示出木質(zhì)素的作用。

2.4 真菌群落

在真菌18S rRNA基因的高通量測序中，16個樣品一共獲得181萬條ITS基因序列，單個樣品的序列數(shù)為35 534 ~ 73 266，在97% 序列相似性水平獲得1 780個OTU。每個樣品隨機抽樣35 534條序列做OTU 表，在此基礎(chǔ)上分析土壤真菌的群落組成。結(jié)果顯示，經(jīng)過3個月的培養(yǎng)之后，真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化(圖3B)，R處理與RE處理有一定的分離，表明蚯蚓對真菌群落產(chǎn)生了一定的影響；RL處理與R處理相距較遠，除了一個異常點，提示木質(zhì)素對真菌群落也同樣產(chǎn)生了較大的影響；而RLE處理卻與R處理聚集在一起，與R處理的群落結(jié)構(gòu)類似。

將相對豐度大于1% 的真菌做堆積圖(圖4B)，可見，在R處理中主要的門是子囊菌門(Ascomycota)、Mortierellomycota、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，分別占比75.01%、10.78%、6.25%。木質(zhì)素促進了擔(dān)子菌的相對豐度，降低了子囊菌的相對豐度；蚯蚓同樣提高了擔(dān)子菌的相對豐度，降低了子囊菌的相對豐度。但這一趨勢在RLE處理中得到逆轉(zhuǎn)，相比單一木質(zhì)素RL處理，蚯蚓加木質(zhì)素促進了子囊菌的相對豐度，降低了擔(dān)子菌的相對豐度。

3 討論

木質(zhì)素可以被用作土壤改良劑、肥料等，也是具有修復(fù)潛力的污染土壤生物刺激材料[13]。本研究中，木質(zhì)素顯著降低了黑麥草的生物量，這與Wu等[2]的研究結(jié)果一致?？赡茉蚴?，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在其降解過程中會產(chǎn)生酚酸類的小分子化合物[3]，而這些酚酸類物質(zhì)與生物堿、萜類共同被稱為自毒物質(zhì)，對植物的生長有抑制作用。Blum[4]發(fā)現(xiàn)從植物組織或分泌物中分離出來的多種酚酸類物質(zhì)會抑制植物生長，劉曉珍等[14]發(fā)現(xiàn)引起菊花連作障礙的主要原因包括酚酸類物質(zhì)的積累和微生物區(qū)系的改變。酚酸類物質(zhì)通過影響植物的膜系統(tǒng)、光合作用、土壤理化性質(zhì)、酶活性和土壤微生物等，對植物生長產(chǎn)生抑制作用[15]。

在本研究中，木質(zhì)素對細菌、真菌的數(shù)量具有明顯的抑制作用，對細菌、真菌的群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了很大的影響。這些變化可能與木質(zhì)素的降解過程有關(guān)。木質(zhì)素的分解釋放出酚酸類結(jié)構(gòu)單體和甲基，具有不同的降解途徑。從細菌群落分析可以看出，在單一木質(zhì)素RL處理中富集的Prolixibacteraceae、Bacteroidetes vadinHA17、Christensenellaceae、Sphingomonadaceae、Archangiaceae等門類，在植物生物質(zhì)降解中常被刺激。例如，Ji等[16]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈降解過程中后期土壤中Prolixibacteraceae的WCHB1-32和Bacteroidetes vadinHA17類群增加，表明它們可能參與秸稈難降解組分如木質(zhì)素的分解；Christensenellaceae屬于梭菌目，包括多種潛在的纖維素降解類群[16]；Sphingomonadaceae中的Sphingobium常用作木質(zhì)素酚酸類單體的模式降解菌，SphingobiumSYK-6的降解途徑已經(jīng)得到深入研究[3]；Archangiaceae的Anaeromyxobacter主要是參與鹵代芳香化合物的厭氧降解[17]。木質(zhì)素代謝過程中釋放出大量甲基，可以進入C1代謝，這解釋了木質(zhì)素對Methylophilaceae的促進作用，提示甲基營養(yǎng)代謝方式的存在[18]。另外，木質(zhì)素明顯地促進了真菌擔(dān)子菌的相對豐度，主要是Tremellomycetes和Agaricomycetes，兩者均具有降解木質(zhì)素、纖維素和酚類物質(zhì)的潛力[19]，Agaricomycetes中含有白腐真菌，而白腐真菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素[20]。總的來說，本研究中的木質(zhì)素處理導(dǎo)致許多潛在降解菌屬的富集，是木質(zhì)素分解的有力證據(jù)，而分解中釋放大量酚酸，可能是導(dǎo)致木質(zhì)素脅迫黑麥草生長的主要原因。

蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，蚯蚓的活動(取食、消化、排泄、分泌和掘穴)可以影響微生物的數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)，從而影響植物生長[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓能夠顯著促進黑麥草的生長，幾乎達到未加蚯蚓處理的2倍。蚯蚓對細菌的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)影響不大，顯著富集Blastocatellaceae和Rhizobiaceae等。Blastocatellaceae與多聚物類碳源代謝顯著正相關(guān)[22]；Rhizobiaceae的Rhizobium屬于禾草內(nèi)生固氮菌，具有固氮酶活性、溶磷、分泌植物生長激素等多種性能[23]。蚯蚓對真菌的數(shù)量有所提高，可能刺激根際土壤生物活性[24]，促進菌絲向植物傳遞養(yǎng)分作用，從而促進植物生長[25]。

蚯蚓能夠緩解木質(zhì)素對植物的抑制作用，顯著促進植物的生物量。究其原因，一方面，可能是由于蚯蚓的作穴、攪動活動增加土壤的孔隙度[26]，加速包括木質(zhì)素在內(nèi)的土壤養(yǎng)分物質(zhì)的循環(huán)[27]，促進植物吸收，并體現(xiàn)在土壤微生物數(shù)量方面；另一方面，蚯蚓可能影響木質(zhì)素及其酚酸類產(chǎn)物的降解過程，緩解其對植物產(chǎn)生的化感作用，調(diào)節(jié)微生物群落，從而提高植物的生物量。畢艷孟和孫振鈞[21]發(fā)現(xiàn)蚯蚓能夠顯著降低土壤中酚類化合物的殘留，并且其降解過程主要是通過微生物作用。從本文結(jié)果可以看到，RLE處理中細菌和真菌rRNA基因拷貝數(shù)在4個處理中最高，是RL處理的2倍以上，表明在木質(zhì)素和蚯蚓組合處理下，微生物活動也增強，這離不開木質(zhì)素和蚯蚓的共同作用。添加了木質(zhì)素的土壤經(jīng)蚯蚓消化道后性質(zhì)得到改善，有利于細菌對養(yǎng)分的利用，在這過程中蚯蚓分泌的代謝產(chǎn)物如黏液、尿素等，對土壤有機質(zhì)產(chǎn)生刺激效應(yīng)，從而刺激細菌的迅速生長[28]。郝月崎等[29]研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓的加入對細菌和真菌數(shù)量的恢復(fù)都有一定的促進作用，添加了蚯蚓的處理組土壤pH更接近中性，可溶性有機碳含量更高，為土壤微生物提供了適宜的生長環(huán)境。對于木質(zhì)素的潛在降解菌Prolixibacteraceae、 Sphingomonadaceae、Methylophilaceae等，在木質(zhì)素蚯蚓組合處理中，雖然其相對豐度比單一木質(zhì)素處理略有降低，但鑒于微生物總體數(shù)量的增加，它們的絕對豐度或活性很可能得到提高。這些結(jié)果表明蚯蚓可能在培養(yǎng)過程中影響了木質(zhì)素的降解過程，緩解了其分解過程中產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)對植物的化感作用，從而促進了黑麥草的生長。張尊昊[30]在蚯蚓堆制處理花生殼的研究中發(fā)現(xiàn)，接種蚯蚓處理的羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶等酶活力高于未接種蚯蚓對照處理，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率也明顯高于未接種蚯蚓對照處理。對于真菌而言，蚯蚓改善了木質(zhì)素對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，盡管RLE處理的擔(dān)子菌相對豐度相對RL處理有所降低，但RLE處理的真菌數(shù)量幾乎是RL處理的6倍以上，木質(zhì)素降解菌的絕對豐度很可能得到提高，菌絲對養(yǎng)分的傳遞作用也可能得到增強?？傮w而言，蚯蚓可能在改善土壤微結(jié)構(gòu)的同時，調(diào)節(jié)土壤微生物群落，影響了木質(zhì)素及其酚酸類產(chǎn)物的降解，促進了養(yǎng)分供應(yīng)，從而促進了黑麥草的生長。

4 結(jié)論

木質(zhì)素顯著降低黑麥草的生物量，蚯蚓可以緩解木質(zhì)素對黑麥草的脅迫作用。木質(zhì)素影響土壤微生物群落，潛在木質(zhì)素降解菌的富集表明木質(zhì)素發(fā)生降解，而降解過程中釋放出的酚酸類化感物質(zhì)，可能是導(dǎo)致黑麥草生長受阻的主要原因。蚯蚓和木質(zhì)素的聯(lián)合作用，改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，顯著增加了細菌和真菌的數(shù)量，并改變了木質(zhì)素降解菌的豐度，可見蚯蚓通過調(diào)節(jié)土壤中木質(zhì)素及其酚酸類產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，緩解其對植物的化感作用，從而改善植物的生長狀況。本研究可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中木質(zhì)素類物質(zhì)的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。