檢疫性有害生物棗咔實(shí)蠅的快速分子鑒定*

陳光輝 李 焱 張小菊 胡紅英

(1. 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844000；2. 新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844000；3. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046；4.喀什海關(guān)技術(shù)中心，新疆喀什 844000 ；5.烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心，新疆烏魯木齊 830000)

紅棗的維生素含量非常高，具有滋陰補(bǔ)陽的功效，是天然的維生素，棗果甘甜可口，深受人們的喜愛。紅棗樹為溫帶作物，適應(yīng)性強(qiáng)，具有耐旱、耐澇的特性，在我國廣泛種植，果實(shí)尤其以新疆紅棗最為甘甜。然而，研究表明棗咔實(shí)蠅CarpomyavesuvianaCosta對棗果危害嚴(yán)重，給紅棗產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性打擊。棗咔實(shí)蠅是非常危險的重大檢疫性有害生物、在新疆乃至全國棗產(chǎn)業(yè)上有著重要經(jīng)濟(jì)意義的害蟲，該蟲在2007年被列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》(吳恂等，2007；張潤志等，2007；阿地力·沙塔爾等，2008)。

棗咔實(shí)蠅隸屬于雙翅目(Diptera)、實(shí)蠅科(Tephritidae)、實(shí)蠅亞科(Trypetinae)、實(shí)蠅族(Trypetini)、咔實(shí)蠅屬Carpomya(張潤志等，2007)。該蟲已經(jīng)分布于印度、巴基斯坦、毛里求斯、阿富汗、泰國、烏茲別克斯坦、塔吉克斯坦、土庫曼斯坦、伊朗、俄羅斯、阿曼等國(Gyietal.，2003； Azametal.，2004；Farraretal.，2004；Sookaretal.，2006；阿地力·沙塔爾等，2008；胡隴生，2012)。該蟲主要以卵和幼蟲隨寄主果實(shí)、蛹隨土壤、苗木的調(diào)運(yùn)傳播，主要危害棗屬的植物，如紅棗Ziziphusjujuba和酸棗Z．jujubavar．spinosa(Hancocketal.，1994；Farraretal.，2004)；成蟲將卵產(chǎn)于紅棗果實(shí)表面致使產(chǎn)卵部位果肉組織發(fā)育滯緩而形成缺陷，果面可形成斑點(diǎn)和蟲孔；幼蟲蛀食棗果內(nèi)部果肉并形成蛀道導(dǎo)致棗果早熟和腐爛，不蛀食棗核和種仁；棗果被害率可高達(dá)60%～70%以上，產(chǎn)量損失可達(dá)20%以上，嚴(yán)重時棗果絕收(阿地力·沙塔爾等，2008)，給世界多地紅棗產(chǎn)業(yè)造成重大損失(Lakraetal.，1983；陳乃中，1998；Dashadetal.，1999；Stonehouseetal.，2002；Gyietal.，2003a)。阿地力·沙塔爾等(2008)首次報道了該蟲在我國新疆吐魯番地區(qū)的發(fā)生情況，與本文研究為同種但傳播來源不同；目前已對棗咔實(shí)蠅生物生態(tài)學(xué)特性、產(chǎn)卵選擇性及適生性進(jìn)行研究(何善勇等，2009；胡隴生等，2012)。由于該蟲主要以幼蟲形式鉆蛀在棗果內(nèi)取食，成蟲善于飛行，防治較為困難；化學(xué)農(nóng)藥在一定程度上能夠起到防治效果(Singhetal.，2000；Gyietal.，2003a,b)，但不能根除，不是長久之計(jì)。因此，加強(qiáng)檢驗(yàn)監(jiān)管，加強(qiáng)監(jiān)測早期預(yù)警，阻止該蟲傳播擴(kuò)散是減少經(jīng)濟(jì)損失的有效方法。

棗咔實(shí)蠅的快速準(zhǔn)確鑒定是監(jiān)測預(yù)警防控的基礎(chǔ)，在口岸一線及果園檢測預(yù)警對該蟲實(shí)現(xiàn)快速鑒定是減少和降低該蟲入侵風(fēng)險和危害的重要屏障。目前，對于棗咔實(shí)蠅的鑒定依賴于的形態(tài)特征，該蟲的蛹、成蟲近似種樣本均很難辨認(rèn)，不能快速實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定，嚴(yán)重影響預(yù)測預(yù)警和后期防治，以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA條形碼技術(shù)能夠解決此類問題(馬英等，2012)。

物種DNA分子鑒定是由Tautz等(2002)、Hebert等(2003a,b)和Ward等(2005)提出，利用DNA序列的保守性和變異性對多個物種進(jìn)行了分類鑒定。利用分子生物學(xué)手段，結(jié)合生物信息學(xué)分析和信息提交等步驟(楊倩倩等，2012；陳光輝等，2018)，發(fā)現(xiàn)具有足夠變異的標(biāo)準(zhǔn)化短基因片段(兼具保守性和變異性)來區(qū)分物種(劉慎思，2012)。目前在昆蟲線粒體基因中，常選用COI、COII、16SRNA鑒定物種(郭玉燕等，2017)，多數(shù)物種的COI序列的種內(nèi)遺傳距離大多小于2%，而種間遺傳差異相對較高(Hebertetal.，2003；Wardetal.，2005；Folmeretal.，2006; Hajibabaeietal.，2006；張媛等，2011)，能夠廣泛用于動物種及種群研究。由于ITS2等序列選擇壓力小，變異較大，種內(nèi)遺傳差異相對其他基因較高，適合物種及其種群的研究(黃華平等，2006)。關(guān)于棗咔實(shí)蠅DNA條形碼基因發(fā)掘較少，有待進(jìn)一步豐富。

在DNA條形碼鑒定時，經(jīng)常出現(xiàn)某個基因擴(kuò)增不出的情況，對多個條形碼進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)快速鑒定非常有必要。本研究旨在對棗咔實(shí)蠅進(jìn)行DNA條形碼研究，克服傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)鑒定方法存在的不足，充分挖掘棗咔實(shí)蠅多個分子鑒定靶點(diǎn)，獲得相關(guān)基因分子數(shù)據(jù)，作為形態(tài)學(xué)特征的補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)不同樣品狀態(tài)的快速鑒定，為該蟲快速鑒定、早期防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備

體視顯微鏡(Motic Cam2506 SMZ168)、 PCR 儀(Biometra TProfessional standard Gradient Thermocycler)、高速低溫離心機(jī)(Beckman CoulterTMAllegraTMX-22R Centrifuge)、制冰機(jī)(SANYO Ice Maker SIM-F140AY65)、電泳儀(JY1600C)、水平電泳槽(美國 Bio-Rad)、凝膠成像儀(BioRad Molecular Imager Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng))、振蕩器(IKA MS3 digital)和恒溫水浴鍋等。

1.2 標(biāo)本采集和保存

2018年7～8月從喀什海關(guān)旅客攜帶物中截獲該蟲標(biāo)本。將蛹至于含有潮濕沙土的50 mL離心管中，紗布用皮筋箍緊離心管口，在室溫下將蛹孵化并收集成蟲。觀察蛹和成蟲樣品外觀形態(tài)。將該蟲蛹和成蟲整理后保存于含有99%酒精的離心管中，并放置于冰箱4 ℃冷藏保存，做為DNA提取材料。

1.3 基因組 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

1.3.1基因組 DNA 的提?。簶悠稤NA采用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取，具體操作步驟見試劑盒(Cat.#DP304-02, RT(15-20 ℃))說明書。

1.3.2基因片段PCR 擴(kuò)增：引物由上海生工合成，具體引物序列及參考文獻(xiàn)如表1所示。擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包括1.5 U Taq酶，0.25 mmol/L dNTP，1×反應(yīng)緩沖液，2.0 mmol/L Mg2+，上下游引物各為通用引物0.3 μmol/L，DNA 模板50 ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 45 s，45(55)℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循環(huán) 40次；最后 72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物送至安徽通用生物技術(shù)公司進(jìn)行測序(雙脫氧法)。

表1 PCR 擴(kuò)增引物及其參考文獻(xiàn)Tab.1 PCR primer designed and the reference cited

1.4 序列數(shù)據(jù)處理及分子系統(tǒng)樹構(gòu)建

用 Dnastar Package 中的Editseq軟件進(jìn)行正反鏈拼接匹配校正測序獲得的基因序列。在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上運(yùn)行 BLAST程序進(jìn)行序列相似性比較，確定所獲得的序列是否是昆蟲的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列。根據(jù)相似度和種內(nèi)遺傳距離對樣品進(jìn)行分子鑒定。結(jié)合從GenBank 中比對的與所獲得的ITS2、12SrRNA、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII序列相似性較高的該蟲的相關(guān)序列，用ClustalX1.83軟件比對，非保守區(qū)域去除。用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA6.0(Kumaretal.，2004；金倩等，2013)分析各物種間DNA序列的差異，基于 Kimura-2-Parameter模型，用鄰近法(NJ, Neighbour-Jioning)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支以1 000次循環(huán)估計(jì)系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)的重復(fù)檢驗(yàn)(褚棟等，2005; 林麗莉等，2010)。

2 結(jié)果

2.1 棗咔實(shí)蠅形態(tài)學(xué)鑒定

棗咔實(shí)蠅的分類地位已經(jīng)明確，屬于完全變態(tài)昆蟲，可分為卵、幼蟲、蛹、成蟲4個發(fā)育形態(tài)，其形態(tài)特征如表2所示。

表2 棗咔實(shí)蠅形態(tài)特征Tab.2 Morphological characteristics of Carpomya vesuviana

2.2 分子鑒定結(jié)果

測序獲得了該蟲蛹和成蟲樣品ITS2、12SrRNA、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因的部分序列，依據(jù)表3中在NCBI數(shù)據(jù)庫中查閱的相關(guān)序列的覆蓋度、相似度最高的GenBank No.等信息進(jìn)行鑒定。覆蓋度較低，且序列相似度低于種內(nèi)遺傳距離的補(bǔ)數(shù)時，確定為新的條形碼序列；表明數(shù)據(jù)庫中未檢索到相關(guān)相似序列，核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列相似度較低，確定為該蟲樣品的新序列。本文獲得的棗咔實(shí)蠅核酸序列較多，共獲得16條，其中COI-5′基因2條為已有報道的鑒定序列，在BOLD中被鑒定為：棗咔實(shí)蠅Carpomyavesuviana，BIN ID:BOLD:ACH5208；其余14條在NCBI中未能鑒定出，為未見報道的新序列。

表3 NCBI比對結(jié)果Tab.3 NCBI Blast results

2.3 ITS1、ITS2、CYT-B、COI堿基含量統(tǒng)計(jì)

將所測序列進(jìn)行拼接校對，在NCBI 網(wǎng)站上運(yùn)行BLAST 程序可以確定測得序列為昆蟲的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列。通過與 GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行比較，結(jié)合 GenBank 中下載的與該相應(yīng)序列相似性較高的棗咔實(shí)蠅的序列，用 ClustalX1.83 軟件進(jìn)行比對，將非保守區(qū)域去除，測序拼接后僅以表4中的序列長度進(jìn)行分析。通過DNAman軟件分析本文所獲得的各個基因序列所有位點(diǎn)中AT堿基含量和GC堿基含量如表4所示。序列堿基含量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，所測樣品線粒體基因，如COI、Cytb，AT/GC 含量相比，AT顯著高于GC，結(jié)果符合昆蟲線粒體基因AT堿基偏嗜特性。

表4 核苷酸使用頻率統(tǒng)計(jì)Tab.4 Nucleotides frequency statistics

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建與分析

將獲得的該蟲蛹和成蟲樣本的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII序列在NCBI中進(jìn)行比對，可獲得得分高低和相似度高低排列表，結(jié)合GenBank 中下載與該蟲相應(yīng)序列相似性較高的相關(guān)序列，用 ClustalX1.83 軟件去除相似性較差區(qū)域，用MEGA6.0構(gòu)建該蟲科部分屬種ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII相關(guān)序列的NJ系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹分析表明，該蟲相關(guān)序列與所屬更高階元的某些種類較為親近，說明該類序列是該蟲相關(guān)序列，同時通過聚類不同序列反應(yīng)得出了相應(yīng)親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 分子鑒定的基礎(chǔ)

DNA條形碼技術(shù)克服了形態(tài)學(xué)鑒定在實(shí)際應(yīng)用中的諸多局限，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的昆蟲鑒定方法的不足之處，為種類鑒定提供了簡單快速準(zhǔn)確的鑒定方法，同時為分類學(xué)家鑒定和發(fā)現(xiàn)復(fù)合組(體)、種團(tuán)和近緣種提供了新方法。雖然形態(tài)學(xué)鑒定在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多局限，但是脫離了形態(tài)分類，以引物檢索設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)的DNA條形碼技術(shù)將無法進(jìn)行，即形態(tài)分類的大致類群是設(shè)計(jì)和檢索擴(kuò)增DNA條形碼序列引物的基礎(chǔ)。因此利用分類學(xué)特征(外在形態(tài)特征，如形狀、大小、顏色等)對物種進(jìn)行初步鑒定后，再結(jié)合DNA條形碼鑒定是更加高效準(zhǔn)確的鑒定方法。

3.2 引物與序列分析

檢索并設(shè)計(jì)特異性引物是獲得目標(biāo)核酸片段的基礎(chǔ)。本研究中檢索或設(shè)計(jì)的CYT-B、COI基因引物為每個基因2對，均能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，表明這4對引物都可以用來對該物種進(jìn)行快速鑒定，不同長度(CYT-B)不同部位(COI)攜帶的信息量不同，但都能用于該物種的快速鑒定。

核酸使用率統(tǒng)計(jì)表明，ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列的AT含量明顯高于GC含量，表現(xiàn)明顯的A+T堿基偏嗜，且A與T含量相當(dāng)，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。對本文所獲得的各個基因序列分析表明，這些基因序列均能在分子水平上對棗咔實(shí)蠅進(jìn)行檢測分析。

雖然未找到多個基因的相似序列，但本文中棗咔實(shí)蠅蛹和成蟲樣品的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII序列分別均為單個同一樣品蛹或成蟲中獲得，在COI-5′獲得鑒定結(jié)果以后，可有確定他們都為該蟲的新序列。在COI獲得鑒定結(jié)果以后，其他序列也是從該昆蟲樣品中獲得序列，因此獲得了多條其他條形碼序列，且獲得的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII新序列較多。

3.3 分子鑒定結(jié)果

在NCBI 網(wǎng)站上運(yùn)行BLAST程序，鑒定結(jié)果如表3所示，COI-5′、COI-3′基因相似度大于98%，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確鑒定；依據(jù)COI-5′基因，棗咔實(shí)蠅蛹和成蟲樣品在BOLD中被鑒定為：棗咔實(shí)蠅Carpomyavesuviana，BIN ID:BOLD:ACH5208。通過表3中ITS2、CYT-B-C、CYT-B-D、COII基因比對數(shù)據(jù)分析可知，相似性較低，通過COI-5′基因已經(jīng)證明為棗咔實(shí)蠅樣品，通過相關(guān)基因且未能識別為棗咔實(shí)蠅樣品，說明棗咔實(shí)蠅的該類基因核酸數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中較少。數(shù)據(jù)庫中無相似數(shù)據(jù)，說明該核酸序列為新序列，新的核酸序列經(jīng)常出現(xiàn)，說明數(shù)據(jù)庫中該物種的序列不夠豐富(如文中COII等)，基因序列相似度較低，無法實(shí)現(xiàn)快速鑒定。

在對昆蟲進(jìn)行分子鑒定時，新核酸序列、首次分子數(shù)據(jù)傳入的重要性等情況需要悉知。未經(jīng)過權(quán)威形態(tài)鑒定，將首次獲得核酸序列傳入數(shù)據(jù)庫中，造成后續(xù)研究者錯誤比對鑒定錯的情況是存在的，因此首次提供的分子數(shù)據(jù)對標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確形態(tài)鑒定是非常重要的，這樣獲得的分子數(shù)據(jù)才會對后續(xù)的分子鑒定有指導(dǎo)意義。

3.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從分子系統(tǒng)樹可以看出，本實(shí)驗(yàn)樣品的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII序列均和昆蟲相關(guān)序列具有很高的相似性，并且和已知的該蟲或相近種屬相關(guān)序列以較高置信值聚在一起，數(shù)據(jù)比對和建樹聚合結(jié)果均顯示該類樣品基因序列可從分子水平對該蟲進(jìn)行分析鑒定。

數(shù)據(jù)庫信息數(shù)據(jù)量在分子系統(tǒng)學(xué)中的重要地位。CYT-B-C、CYT-B-D為CYT-B不同長度對比，通過表3中CYT-B-C、CYT-B-D相似度、覆蓋度數(shù)據(jù)和NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(CYT-B-C未構(gòu)建)分析可知，CYT-B-C雖然核酸序列信息豐富，但是數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)相對缺乏，不能充分發(fā)揮利用該基因的鑒定效果；CYT-B-D核酸序列信息較CYT-B-C相對少了很多，但系統(tǒng)進(jìn)化鑒定指示信息明確，這說明一定長度的核酸序列已經(jīng)還有了足夠能夠鑒定物種的數(shù)據(jù)；由于數(shù)據(jù)庫中CYT-B-D核酸序列信息豐富，能夠?qū)⒃撓x的CYT-B-D基因序列聚為一簇，發(fā)揮了較好的鑒定適用性，這說明數(shù)據(jù)庫中該類數(shù)據(jù)量越豐富越有利于物種鑒定。

不同基因適用于不同階元的分類研究。從ITS2、CYT-B-C、CYT-B-D、COII、COI-5′、COI-3′基因和序列NJ系統(tǒng)樹可以看出，該類昆蟲能將種階元的樣品聚在成一簇，說明該類基因適用于該類昆蟲分種研究。通過圖2中多個基因 NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，該類棗咔實(shí)蠅樣本的多個基因序列與Rhagoletis親緣關(guān)系較近。從16SrRNA基因NJ系統(tǒng)樹可以看出，該類昆蟲屬及以上階元聚為一簇，說明該類基因可以用于鑒定該類昆蟲屬及以上階元的分類研究。

圖2 棗咔實(shí)蠅種類鑒定靶標(biāo)序列的NJ 分子系統(tǒng)樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of identical sequences from related species of Carpomya vesuviana圖中數(shù)字表示置信度；本文的樣本用實(shí)心三角標(biāo)出. A: ITS2; B: COI-5′; C: COI-3′; D: COII; E: 12S rRNA; F: 16S rRNA; G: CYT-B-D.Integer indicates bootstrap confidence values，and samples in this study were marked in solid triangle. A: ITS2; B: COI-5′; C: COI-3′; D: COII; E: 12S rRNA; F: 16S rRNA; G: CYT-B-D.

可以通過種群關(guān)系推斷害蟲傳播路徑。通過圖2-C與棗咔實(shí)蠅相關(guān)的部分種類的COI-3′基因 NJ 分子系統(tǒng)樹可以說明，本研究截獲的棗咔實(shí)蠅樣本與北疆的樣本關(guān)系較遠(yuǎn)，與來自伊朗的實(shí)蠅樣本親緣關(guān)系較近，與阿地力·沙塔爾(2008)的研究結(jié)果中的KSS樣本較為一致，提示KSS樣本不是從吐魯番傳入南疆，可能是從伊朗或者其他的路線侵入我國，需要加強(qiáng)監(jiān)測預(yù)警，警惕傳入和擴(kuò)散風(fēng)險。

本研究利用DNA分子鑒定技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)分類方法，通過提取該蟲DNA，檢索適用于該蟲相關(guān)基因擴(kuò)增的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，獲得了棗咔實(shí)蠅的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII的序列，序列比對和NJ樹分析表明這些序列都可作為該蟲DNA分子鑒定靶點(diǎn)；對于某些適合種群演變關(guān)系研究的基因，如COI不僅能夠?qū)ΨN就行有效鑒別，而且可以對種群親緣關(guān)系遠(yuǎn)近進(jìn)行分析，為種群入侵或傳播途徑提供依據(jù)；該研究獲得的DNA分子特征,豐富了文中該蟲基因序列的數(shù)據(jù)庫，為快速鑒定提供多條新的參考序列，為該蟲快速鑒定、預(yù)警防控和早期防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。