糞便標(biāo)本溶組織內(nèi)阿米巴原蟲Real-Time PCR檢測(cè)方法的建立及初步評(píng)價(jià)*

張春瑩 龐華勝 匡紫微 孟妍明 劉成桂 馬 瑩**

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041; 2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川成都 610091)

溶組織內(nèi)阿米巴原蟲Entamoebahistolytica(E.histolytica)為內(nèi)阿米巴科的內(nèi)阿米巴屬原蟲，是目前國(guó)際公認(rèn)的具有致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，對(duì)動(dòng)物和人具有侵襲性。近年來(lái)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲在HIV/AIDS人群中的感染率呈上升趨勢(shì)，是HIV/AIDS人群中感染率最高的致病性腸道原蟲之一(Loetal.，2014；管悅等，2015)，也是導(dǎo)致患者長(zhǎng)期性腹瀉的主要病原體。由溶組織內(nèi)阿米巴原蟲引起的侵襲性阿米巴病是全球寄生蟲感染相關(guān)死亡的主要來(lái)源，每年造成40 600～73 800人死亡(Lozanoetal.，2012)，在我國(guó)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染仍是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，溶組織內(nèi)阿米巴病的診斷在國(guó)內(nèi)外均主要依靠涂片鏡檢法(Stanleyetal., 2003；鄧爽等，2018)，但形態(tài)學(xué)鏡檢依賴檢驗(yàn)者的豐富經(jīng)驗(yàn)，且形態(tài)學(xué)無(wú)法區(qū)分致病性溶組織內(nèi)阿米巴原蟲E.histolytica和非致病性迪斯帕內(nèi)阿米巴原蟲Entamoebadispar(E.dispar)(Fotedaretal., 2007; McHardyetal., 2014)；免疫學(xué)ELISA方法簡(jiǎn)單快速，但有些檢測(cè)試劑不能準(zhǔn)確區(qū)分E.histolytica和E.dispar，且目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化ELISA試劑盒，只能從國(guó)外購(gòu)買、價(jià)格昂貴；PCR方法簡(jiǎn)單快速，敏感性和特異性高，能夠區(qū)分E.histolytica和E.dispar，可有效對(duì)感染蟲體量較少的腹瀉患者進(jìn)行輔助診斷，國(guó)內(nèi)外學(xué)者評(píng)估報(bào)道了普通PCR法(龐華勝等，2019)和巢式PCR法(Shahrametal.，2006; 盧艷等，2016)在檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染中的應(yīng)用，但使用Real-Time PCR方法的研究較少。本研究建立了可特異擴(kuò)增溶組織內(nèi)阿米巴原蟲小亞基核糖體RNA(small subunit ribosome RNA，SSU rRNA)基因的Real-Time PCR方法，同時(shí)評(píng)價(jià)該方法在臨床糞便標(biāo)本中檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本：收集腹瀉患者的稀便或水樣便標(biāo)本共221例，其中華西醫(yī)院收集成人標(biāo)本112例(女58例，男54例，年齡18～57歲)，成都市婦女兒童醫(yī)院收集兒童標(biāo)本109例(女50例，男59例，年齡3月～5歲)。每份標(biāo)本均及時(shí)進(jìn)行生理鹽水涂片鏡檢(碘染法)、ELISA法抗原檢測(cè)和糞便DNA提取。試劑： ELISA法檢測(cè)使用TECHLAB第2代溶組織內(nèi)阿米巴原蟲特異性抗原檢測(cè)試劑盒(Alere公司)，檢測(cè)糞便樣本中E.histolytica的半乳糖/N2乙酰氨基半乳糖胺(Gal/GalNAc)粘附凝集素抗原；糞便DNA提取使用Feces Fast DNA Spin Kit試劑盒(MP Biomedicals公司)。溶組織內(nèi)阿米巴原蟲DNA：標(biāo)準(zhǔn)株(HM-1:IMSS)基因組DNA(ATCC30459D)，質(zhì)量濃度為50 ng/μL。

1.2 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的擴(kuò)增引物

在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找溶組織內(nèi)阿米巴原蟲基因組DNA，欲擴(kuò)增的目的片段為溶組織內(nèi)阿米巴原蟲小亞基核糖體RNA(small subunit ribosome RNA，SSU rRNA)基因(GenBank登錄號(hào)X64142.1)，根據(jù)課題組前期的普通PCR結(jié)果(龐華勝等，2019)，選出表現(xiàn)較好且能特異性區(qū)分E.histolytica和E.dispar的兩對(duì)引物(Eh-239f/Eh-88 r和Eh-60f/Eh-60 r)，進(jìn)行Real-Time(SYBR)PCR擴(kuò)增；設(shè)計(jì)taqman探針，用于Real-Time(taqman)PCR擴(kuò)增。引物、SYBR和Taqman探針均由成都擎科梓熙(TSINGKE)生物技術(shù)有限公司合成。引物序列詳見(jiàn)表1，其中1對(duì)引物為自行設(shè)計(jì)，1對(duì)引物來(lái)自參考文獻(xiàn)。

1.3 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA的Real-Time PCR擴(kuò)增

課題組前期的普通PCR擴(kuò)增中，使用上述兩對(duì)引物(Eh-239f/Eh-88 r，Eh-60f/Eh-60 r)時(shí)模板DNA的最低檢測(cè)限分別為5 fg/uL和0.5 fg/μL，理論上Real-Time PCR的檢測(cè)靈敏度高于普通PCR，因此Real-Time PCR擴(kuò)增時(shí)將DNA模板從5 fg/μL濃度開始繼續(xù)進(jìn)行稀釋(表2)。Real-Time(SYBR)PCR擴(kuò)增：以原始模板DNA濃度即50 ng/μL及稀釋后不同濃度的溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板(表2)，采用表1中的2對(duì)引物進(jìn)行Real-Time(SYBR)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，然后95 ℃變性10 s，T℃退火15 s (T退火溫度見(jiàn)表1)，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)于退火溫度處采集熒光信號(hào)。Real-Time(Taqman)PCR擴(kuò)增：以原始模板DNA濃度即50 ng/uL及稀釋后不同濃度的溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板(表2)，采用表1中的2對(duì)引物，同時(shí)設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的Taqman探針，進(jìn)行Real-Time(Taqman)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同Real-Time(SYBR)PCR擴(kuò)增方法。

表1 兩對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲特異性引物序列Tab.1 Specific primers for Entamoeba histolytica

表2 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA的稀釋倍數(shù)及濃度Tab.2 The series of diluted concentration of E. histolytica for PCR

1.4 不同方法檢測(cè)臨床糞便標(biāo)本(以臨床診斷為判斷陽(yáng)性的依據(jù))

生理鹽水涂片鏡檢(碘染法)：嚴(yán)格按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)的相關(guān)要求進(jìn)行操作，顯微鏡下查找有無(wú)阿米巴原蟲包囊或滋養(yǎng)體。ELISA抗原檢測(cè)：操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)有效性判定：陰性對(duì)照A值<0.15，陽(yáng)性對(duì)照A值-陰性對(duì)照A值≥0.5證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。陽(yáng)性樣本判定：測(cè)試樣本A值-陰性對(duì)照A值≥0.5時(shí)判定為陽(yáng)性，否則為陰性。DNA提?。翰僮鞣椒ò凑赵噭┖姓f(shuō)明書進(jìn)行，提取后的DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩eal-Time PCR擴(kuò)增：以提取的樣本DNA為模板，分別進(jìn)行Real-Time(SYBR)PCR和Real-Time(Taqman)PCR。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同1.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)3種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，并用McNemar檢驗(yàn)觀察3種方法檢測(cè)結(jié)果有無(wú)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA的Real-Time PCR擴(kuò)增

Real-Time (SYBR) PCR擴(kuò)增：以原始DNA濃度為模板，使用表1中的引物(Eh-239f/Eh-88r，Eh-60f/Eh-60r)進(jìn)行Real-Time (SYBR) PCR擴(kuò)增，均得到陽(yáng)性結(jié)果。以不同稀釋倍數(shù)的DNA為模板(表2)進(jìn)行Real-Time (SYBR) PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。使用兩對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)，模板DNA的最低檢測(cè)限均為0.5 fg/μL。

圖1 引物Eh-239f/Eh-88r和引物Eh-60f/Eh-60r的Real-Time (SYBR) PCRFig.1 Real-Time (SYBR) PCR with primer Eh-239f/Eh-88 r and Eh-60f/Eh-60 r1-4: 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA模板稀釋后的濃度50, 5, 1, 0.5 fg/μL。下同。1-4: DNA concentration of Entamoeba histolytica DNA after series of dilution with 50, 5, 1, 0.5 fg/μL, and the same below.

Real-Time (taqman) PCR擴(kuò)增：以原始DNA濃度為模板，使用表1中的引物(Eh-239f/Eh-88r，Eh-60f/Eh-60r)進(jìn)行Real-Time (taqman) PCR擴(kuò)增，均得到陽(yáng)性結(jié)果。以不同稀釋倍數(shù)的DNA為模板(表2)進(jìn)行Real-Time (taqman) PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。使用兩對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)，模板DNA的最低檢測(cè)限均為0.5 fg/μL。

圖2 引物Eh-239f/Eh-88r和引物Eh-60f/Eh-60r的Real-Time (taqman) PCR方法Fig.2 Real-Time (Taqman) PCR with primer Eh-239f/Eh-88 r and Eh-60f/Eh-60 r

2.2 不同方法檢測(cè)臨床糞便標(biāo)本的結(jié)果比較

本研究共221例糞便標(biāo)本中，濕片生理鹽水涂片鏡檢法(碘染法)檢出2例阿米巴原蟲包囊(2/221)，均為成年患者，檢出率0.90%；ELISA法檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲抗原，檢出21例陽(yáng)性(21/221)，其中12例成人標(biāo)本，9例兒童標(biāo)本，陽(yáng)性檢出率9.50%；兩種Real-Time PCR方法均檢出5例陽(yáng)性(5/221)，陽(yáng)性檢出率2.26%(表3)。

表3 鏡檢法、ELISA法、Real-Time PCR法檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本及結(jié)果Tab.3 The results of microscopy, ELISA and Real-Time PCR

Real-Time (SYBR) PCR和Real-Time (taqman) PCR方法檢測(cè)結(jié)果完全一致，且臨床表現(xiàn)和診斷支持溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染。Real-Time PCR法檢出陽(yáng)性的5例標(biāo)本中，2例鏡檢法和ELISA法的結(jié)果均為陽(yáng)性(153、197號(hào)標(biāo)本)，2例鏡檢陰性而ELISA法陽(yáng)性(36、82號(hào)標(biāo)本)，1例鏡檢法和ELISA法均為陰性(57號(hào)標(biāo)本)。三種方法的檢測(cè)結(jié)果一致性比較見(jiàn)表4。

表4 鏡檢法、ELISA法、Real-Time PCR檢測(cè)法的比較Tab.4 Comparison of microscopy observations, ELISA and PCR methods

3 討論

溶組織內(nèi)阿米巴原蟲為內(nèi)阿米巴科的內(nèi)阿米巴屬原蟲，是唯一具有致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，可引起腸阿米巴病(如阿米巴痢疾)和腸外阿米巴病(如阿米巴肝膿腫)，是導(dǎo)致患者腹瀉的主要病原體之一，目前溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染仍是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。而內(nèi)阿米巴屬中的非致病性阿米巴—迪斯帕內(nèi)阿米巴E.dispar的遺傳背景、原蟲形態(tài)和宿主與溶組織內(nèi)阿米巴原蟲高度相似(Fotedaretal.，2007)。為避免過(guò)度診斷和過(guò)度治療，快速準(zhǔn)確的對(duì)病原體進(jìn)行鑒定尤為重要。

溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染的實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括病原學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。顯微鏡涂片檢查是常用的病原學(xué)診斷方法，也往往是診斷的依據(jù)，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性較低，容易漏檢，而且無(wú)法將包囊和滋養(yǎng)體形態(tài)極為相似的致病性的E.histolytica與非致病性E.dispar區(qū)分(Stanleyetal., 2003)。因此，為正確區(qū)別E.histolytica和E.dispar，本研究建立了可特異擴(kuò)增溶組織內(nèi)阿米巴原蟲SSU rRNA的Real-Time PCR方法，并收集221例腹瀉患者的糞便標(biāo)本，對(duì)該方法在臨床糞便標(biāo)本中檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

本研究中，涂片鏡檢法共檢出兩例阿米巴原蟲包囊，檢出率為0.90%，由于陽(yáng)性數(shù)量較少，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的感染率可比性較差。

免疫學(xué)方法簡(jiǎn)單快速，理論上可區(qū)別E.histolytica和E.dispar，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)成熟的商品化ELISA試劑盒可供使用。本研究使用從國(guó)外購(gòu)買的ELISA試劑盒檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲特異性抗原，檢出21例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為9.50%，檢出率與鏡檢法、PCR法差異較大。該類試劑盒已在國(guó)內(nèi)外不同的實(shí)驗(yàn)室中使用多年，用于檢測(cè)世界范圍流行地區(qū)或非流行地區(qū)的溶組織內(nèi)阿米巴原蟲。在國(guó)內(nèi)研究中，孫曉東等(2006)使用TechLab II溶組織內(nèi)阿米巴原蟲ELISA試劑盒檢測(cè)云南省某地的E.h，檢出率為9.29%，與本研究檢出率相似。劉慧等(2008)報(bào)道ELISA法對(duì)云南省普洱市某愛(ài)尼族村寨常住居民的糞便中溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染的檢測(cè)陽(yáng)性率為12.23%，與PCR法檢測(cè)的符合率為77.36%，符合率高于本研究結(jié)果。國(guó)外研究中，有報(bào)道(Shahrametal.，2006)顯示該試劑盒在溶組織內(nèi)阿米巴原蟲高度流行國(guó)家的檢測(cè)靈敏度達(dá)到95%至100%，但與PCR方法比較，TechLab II試劑盒的檢測(cè)靈敏度較低(Starketal.，2008)。一項(xiàng)在厄瓜多爾北部溶組織內(nèi)阿米巴原蟲高度流行地區(qū)進(jìn)行的研究顯示(Gattietal.，2002)，TechLab II試劑盒的表現(xiàn)不佳(靈敏度為14.3%，特異性為98.4%)。也有研究報(bào)道在溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染低流行地區(qū)，TechLab II試劑盒的檢測(cè)靈敏度較低(Goninetal.，2003)。TechLab II試劑盒在不同流行地區(qū)和不同研究中檢測(cè)的敏感性差別大，可能與溶組織阿米巴原蟲不同的生活階段中的抗原有關(guān)，TechLab II試劑盒只能識(shí)別急性阿米巴原蟲感染導(dǎo)致的腹瀉糞便樣本中的滋養(yǎng)體，而不能識(shí)別包囊階段的寄生蟲(Gattietal.，2002; Starketal.，2008)。由于國(guó)外的試劑盒在不同流行地區(qū)檢測(cè)的靈敏度和特異性差異較大，在應(yīng)用于國(guó)內(nèi)臨床檢驗(yàn)方面還需進(jìn)一步評(píng)估。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)逐漸應(yīng)用到溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染的臨床診斷(盧艷等，2016)，該方法靈敏度和特異度高，廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)和鑒定。本研究采用Real-Time (SYBR) PCR和Real-Time (taqman) PCR技術(shù)均檢出5例陽(yáng)性標(biāo)本，臨床表現(xiàn)和診斷均支持溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染。其中2例鏡檢和ELISA法均陽(yáng)性，2例鏡檢陰性而ELISA法陽(yáng)性，1例鏡檢和ELISA法均陰性。PCR陰性而ELISA陽(yáng)性的17例病例中，6例為住院病人，診療記錄不支持溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染的診斷。我們同時(shí)重新設(shè)計(jì)E.dispar的特異性引物對(duì)這17例標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)2例為E.dispar陽(yáng)性，提示本研究使用的ELISA檢測(cè)試劑盒不能準(zhǔn)確將致病性E.h和非致病性E.dispar區(qū)分，與Visser等和Stark等(2008)的研究結(jié)論一致，而本文設(shè)計(jì)的引物可準(zhǔn)確區(qū)分E.h和E.dispar。文獻(xiàn)報(bào)道使用巢式多重PCR也可將E.h和E.dispar進(jìn)行鑒別和區(qū)分(盧艷等，2016; 闞珍珍等，2018)。綜合分析，本研究3種檢測(cè)方法的結(jié)果中，PCR法顯現(xiàn)出更好的敏感性和特異性，且能夠區(qū)分E.h與其他內(nèi)阿米巴原蟲如E.dispar。

在溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的PCR檢測(cè)技術(shù)中，有兩個(gè)重要關(guān)鍵步驟，一是糞便標(biāo)本的核酸提取，本研究使用專門提取糞便DNA的商品化試劑盒，為美國(guó)CDC推薦使用。二是選擇合適的分子遺傳標(biāo)記，SSU rRNA基因參與編碼溶組織內(nèi)阿米巴原蟲核糖體小亞基，是一段高度保守的核苷酸序列，在致病性E.histolytica和非致病性E.dispar之間存在穩(wěn)定的遺傳差異，被廣泛用于溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的檢測(cè)和鑒別。本研究基于溶組織內(nèi)阿米巴原蟲SSU rRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物，使用Real-Time (SYBR) PCR和Real-Time (taqman) PCR技術(shù)對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA系列稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)引物的表現(xiàn)和PCR的靈敏性，成功建立溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染的Real-Time PCR技術(shù)，可檢測(cè)的最低模板DNA濃度為0.5 fg/μL。與普通PCR相比，Real-Time PCR是在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR 熒光染料或Taqman探針，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好，可進(jìn)行高通量大規(guī)模實(shí)時(shí)檢測(cè)，減少了普通PCR對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行電泳的步驟。Real-Time (SYBR) PCR通用性好，不需要設(shè)計(jì)探針，省時(shí)簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉；Real-Time (Taqman) PCR結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，可進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，但需要設(shè)計(jì)合成特異性探針，檢測(cè)成本稍高，臨床實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)本地溶組織內(nèi)阿米巴原蟲流行情況及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備進(jìn)行選擇應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，采用鏡檢法檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴原蟲滋養(yǎng)體或包囊操作簡(jiǎn)單，但靈敏性最低，主觀性強(qiáng)，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床檢驗(yàn)人員進(jìn)行觀察；ELISA方法快速便捷，但目前尚無(wú)可用的國(guó)產(chǎn)商品化試劑盒，國(guó)外試劑盒的臨床應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步評(píng)估；PCR方法檢測(cè)靈敏度高，模板DNA濃度要求低，可以準(zhǔn)確區(qū)分形態(tài)學(xué)上非常相似的致病性E.histolytica和非致病性E.dispar，可對(duì)臨床可疑的溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，減少或避免臨床漏診，對(duì)臨床指導(dǎo)及流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。但要將Real-Time PCR方法作為成熟的臨床診斷方法并對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行定量檢測(cè)還需要進(jìn)一步研究標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)參設(shè)置等問(wèn)題，內(nèi)參設(shè)置需要篩選穩(wěn)定可靠的溶組織內(nèi)阿米巴原蟲管家基因，目前還未相關(guān)PCR定量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。另外本研究還需擴(kuò)大臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，為建立成熟完善的臨床溶組織內(nèi)阿米巴原蟲感染的Real-Time PCR檢測(cè)方法提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床檢測(cè)其他致腹瀉原蟲的分子生物學(xué)檢測(cè)方法提供參考。