Arntl基因敲除對(duì)小鼠T細(xì)胞發(fā)育及抗感染功能的影響

孫亞娥，焦安君，王 昕，張星哲，雷 蕾，楊小豐，解 濤，周曉勃，史 霖，張保軍,4,5，劉曉斌

(1. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安 716000；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院感染與免疫研究所，陜西西安 710061；4.環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西安交通大學(xué))，陜西西安 710061；5. 西安市免疫相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

芳基烴受體核傳送器樣分子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like, Arntl)也稱為BMAL1、MOP3、BMAL1c、JAP3、PASD3、TIC、bHLHe5，其編碼基因位于小鼠7號(hào)染色體上，是外周時(shí)鐘核心基因，也是目前唯一發(fā)現(xiàn)的單獨(dú)敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠活動(dòng)節(jié)律性失調(diào)的基因[1]。哺乳動(dòng)物的免疫活動(dòng)也呈現(xiàn)節(jié)律振蕩[2]，但在免疫細(xì)胞中，Arntl的作用不僅是調(diào)節(jié)節(jié)律，還影響到免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能。髓系祖細(xì)胞缺失Arntl會(huì)促使其向IL-17+/IFN-γ+T細(xì)胞分化，引起中樞神經(jīng)性自身免疫性疾病(EAE)的惡化[3]；小鼠缺失Arntl(Arntl-/-)會(huì)使外周血和脾臟中的B細(xì)胞數(shù)目減少，導(dǎo)致pre-B細(xì)胞不能分化為成熟的B細(xì)胞[4]；巨噬細(xì)胞缺失Arntl則會(huì)增加其運(yùn)動(dòng)性及吞噬功能，使其能更好地抵抗肺炎球菌引起的感染[5]。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)Immgen數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，Arntl在小鼠DP細(xì)胞中表達(dá)較高，提示其在T細(xì)胞此階段的分化發(fā)育中可能發(fā)揮作用，但目前沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬采用T細(xì)胞特異性敲除Arntl的小鼠模型(ArntlF/FCD4cre+小鼠)研究Arntl對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育及抗感染免疫應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ArntlF/F小鼠和CD4cre+小鼠均購(gòu)自Jackson。ArntlF/FCD4cre+小鼠和ArntlF/FCD4cre-小鼠的飼養(yǎng)和繁殖均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物房〔許可證:SYXK(陜)2020-005〕，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理指南。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑抗體CD4-APC/CY7(clone:GK1.5)、CD8-FITC(clone:53-6.7)、CD44-PE/CY7(clone:IM7)、CD62L-APC(clone:MEL-14)、TCRγδ-PE/CY7(clone:GL3)、CD25-PE(clone:PC61)、FOXP3-APC(clone:MF-14)、IFNγ-PE/CY7(clone:XMG1.1)、Purified anti-mouse CD3ε Antibody(clone:145-2C11)、Purified anti-mouse CD28 Antibody(clone:37.51)、Purified anti-mouse IL-4 Antibody(clone:11B11)和試劑Recombinant Mouse IL-2(Cat:575402)、Recombinant Mouse IL-12(Cat:577002)、Monensin(Cat:420701)、Brefeldin A(Cat:420601)、細(xì)胞破膜劑(Cat:420801)、清洗劑(Cat:421002)均購(gòu)自BioLegend。GP33和CD1d tetramer由NIH Tetramer Core Facility提供。PDBU(Cat:524390)和Ionomycin(Cat:I3909)購(gòu)自Sigma-Aldrich。CountBrightTMabsolute counting beads(Cat:C36950)購(gòu)自invitrogen。RNA提取試劑盒(Cat:DP419)購(gòu)自天根生物。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code No.FSQ-301)購(gòu)自東洋紡。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器流式細(xì)胞儀(型號(hào)：CytoFLEX，BECKMAN)；PCR儀(型號(hào)：BIORAD，Thermal Cycler)；RT-PCR儀購(gòu)(型號(hào)：StepOnePlus，Applied Biosystems)；離心機(jī)(型號(hào)：centrifuge 5810R, Eppendorf)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1條件性敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定將ArntlF/F小鼠和CD4cre轉(zhuǎn)基因小鼠(CD4cre+小鼠)進(jìn)行兩代雜交，獲得對(duì)照組小鼠(ArntlF/FCD4cre-, WT)和基因敲除組小鼠(ArntlF/FCD4cre+, KO)?；蛐丸b定采用PCR擴(kuò)增法，引物序列CD4cre：Forward 5′-GGGTGCCCACTTTTGTGTAT-3′，Reverse 5′-ATGTTTAGCTGGCCCAAATG-3′；Arntl：Forward

5′-ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG-3′，Reverse 5′-CTGACCAACTTGCTAACAATTA-3′。樣本為小鼠腳趾組織，提取DNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀掃描分析。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組6～10周齡的小鼠，基因型ArntlF/FCD4cre-的小鼠為對(duì)照組(WT)，基因型ArntlF/FCD4cre+的小鼠為基因敲除組(KO)。每次實(shí)驗(yàn)取每組小鼠3～5只。

1.2.3病毒感染方法取-80 ℃存放的LCMV病毒，于37 ℃水浴中快速解凍，每只小鼠以2×105PFU劑量腹腔注射。在感染后第8天，分析脾臟中淋巴細(xì)胞的比例及表型。

1.2.4胸腺和脾臟中淋巴細(xì)胞的提取分別取WT(n=3)和KO(n=3)組小鼠的胸腺及脾臟，研磨，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 500 r/min、4 ℃離心5 min。棄上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，作用1 min后加FACS(1×PBS+2% FBS)洗滌2次，用1 mL FACS重懸，備流式檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)目和比例取1.2.4項(xiàng)備好的淋巴細(xì)胞，按體積1∶400的比例加入特定組合抗體，冰上避光孵育30 min，用FACS緩沖液清洗1次后，每管加2 μL CountBrightTMabsolute counting beads，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各類細(xì)胞的數(shù)目和比例。

1.2.6胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)取WT(n=3)和KO(n=3)組的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，按每孔2×105的細(xì)胞密度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入Monensin(2 μmol/L)、Brefeldin A(5 μg/mL)、Ionomycin(0.5 μg/mL)、PDBU(1 μmol/L)，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)4 h后，收集細(xì)胞，用FACS洗滌。進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志抗原染色，然后進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(具體方法詳見BioLegend相關(guān)試劑說(shuō)明書)，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7Th細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化用流式分選儀分選源自WT(n=3)和KO(n=3)小鼠的初始CD4+T細(xì)胞(CD4+CD25-CD44-CD62L+T細(xì)胞)，按每孔1×105的細(xì)胞密度接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板預(yù)先低包被anti-CD3(5 μg/mL)、anti-28(2.5 μg/mL)，培養(yǎng)基中加入IL-2(2.5 ng/mL)、IL-12(20 ng/mL)、anti-IL-4(10 μg/mL)，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)96 h。在培養(yǎng)的第92 h，每孔加入Monensin(2 μmol/L)、Brefeldin A(5 μg/mL)、Ionomycin(0.5 μg/mL)、PDBU(1 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞，用FACS清洗1次后染色。先進(jìn)行表面標(biāo)志抗原染色，再進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ染色(步驟同前)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8qPCR檢測(cè)LCMV病毒載量取LCMV感染后第8天的脾臟細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒提取RNA，用等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測(cè)LCMV病毒載量，引物序列：Forward 5′-TGCCTGACCAAATGGATGATT-3′，Reverse 5′-CTGCTGTGTTCCCGAAACACT-3′。以actin作為內(nèi)參照，計(jì)算病毒的相對(duì)載量。

2 結(jié) 果

2.1 T細(xì)胞中特異性敲除Arntl小鼠的鑒定Arntl+/+的PCR產(chǎn)物大小為327 bp，ArntlF/+的PCR產(chǎn)物大小為327 bp和431 bp，ArntlF/F的PCR產(chǎn)物大小為431 bp(圖1A)。CD4cre+的PCR產(chǎn)物大小為450 bp，CD4cre-的PCR擴(kuò)增條帶則是陰性(圖1B)。對(duì)各型小鼠PCR結(jié)果顯示：T細(xì)胞中特異性敲除Arntl基因的小鼠構(gòu)建成功。

2.2 Arntl敲除對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響WT小鼠(ArntlF/FCD4cre-)和KO小鼠(ArntlF/FCD4cre+)胸腺中DP、CD4+、CD8+、Treg(CD4+CD25+FOXP3+)、γδT(TCRγδ+)、NKT(CD1d+TCRβ+)等主要T細(xì)胞亞群的比例和數(shù)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)；脾臟中CD4+、CD8+、Treg、γδT、NKT等主要T細(xì)胞亞群的比例和數(shù)目也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

2.3 Arntl敲除對(duì)LCMV感染后小鼠脾臟中T細(xì)胞的影響LCMV感染后，WT和KO組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞占總細(xì)胞比例及病毒特異性GP33+T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CD8+的效應(yīng)T細(xì)胞(CD8+CD44+CD62L-)和GP33+的效應(yīng)T細(xì)胞(CD8+GP33+CD44+CD62L-)的比例也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

2.4 Arntl敲除對(duì)脾臟中病毒載量的影響用qPCR的方法檢測(cè)脾臟中LCMV病毒載量，結(jié)果顯示，KO組LCMV的相對(duì)表達(dá)量較WT組顯著降低(P<0.05，圖5)。說(shuō)明KO小鼠脾臟中的病毒含量較少，KO小鼠對(duì)病毒的清除能力較強(qiáng)。

2.5 Arntl敲除對(duì)LCMV感染后小鼠脾臟中T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響為了研究Arntl敲除鼠中病毒載量降低是否與T細(xì)胞的功能增強(qiáng)有關(guān)，本研究分析了LCMV感染后脾臟中CD8+T細(xì)胞和GP33+T細(xì)胞分泌炎性因子IFN-γ的情況。結(jié)果顯示，KO組小鼠中CD8+IFN-γ+T細(xì)胞占總CD8+T細(xì)胞的比例較WT組顯著升高，GP33+IFN-γ+T細(xì)胞的比例占總GP33+T細(xì)胞的比例也顯著升高(P<0.01，圖6A～6D)。

圖2 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠胸腺中各T細(xì)胞亞群的比例和數(shù)目

2.6 Arntl敲除促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化為了探索Arntl在T細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中對(duì)CD4+T細(xì)胞分化的影響，本研究分別分選了WT和KO組小鼠淋巴結(jié)中的初始 CD4+T細(xì)胞(CD4+CD25-CD44-CD62L+)，體外誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化。結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，KO組小鼠的初始CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞的比例顯著升高(P<0.01，圖6F)。

3 討 論

Arntl屬于分子時(shí)鐘基因，控制細(xì)胞生理活動(dòng)的晝夜節(jié)律變化，其表達(dá)水平也隨著晝夜發(fā)生周期性的變化。在T細(xì)胞發(fā)育中，Arntl在DP階段有較高的表達(dá)，但其表達(dá)沒(méi)有明顯的節(jié)律性[6]。T細(xì)胞中Arntl的表達(dá)對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育和功能的影響不太清楚。T細(xì)胞良好的發(fā)育是機(jī)體免疫功能的保障，T細(xì)胞數(shù)量的減少或者比例的變化與疾病的發(fā)生息息相關(guān)[7-10]。本實(shí)驗(yàn)中，T細(xì)胞特異性缺乏Arntl表達(dá)并沒(méi)有引起胸腺、脾臟中主要T細(xì)胞亞群數(shù)目的改變，包括DP細(xì)胞及發(fā)揮效應(yīng)功能的CD4+、CD8+T細(xì)胞和發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的Treg細(xì)胞，因此Arntl不影響T細(xì)胞發(fā)育。本研究結(jié)果與HEMMERS[6]報(bào)道的一致。

圖3 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠脾臟中各T細(xì)胞亞群的比例和數(shù)目

T細(xì)胞在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮重要作用。CD4+T細(xì)胞活化后，輔助調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞及天然免疫細(xì)胞的功能。CD8+T細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等來(lái)發(fā)揮效應(yīng)功能，其功能的升高有利于機(jī)體抵抗病原感染和腫瘤發(fā)生[11-14]。本研究用LCMV感染對(duì)照組(ArntlF/FCD4cre-)和敲除組(ArntlF/FCD4cre+)小鼠，并檢測(cè)病毒載量，發(fā)現(xiàn)敲除組小鼠的病毒載量明顯降低，提示敲除Arntl增強(qiáng)T細(xì)胞的抗病毒功能。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD8+IFN-γ+T細(xì)胞的比例占總CD8+T細(xì)胞的比例顯著升高，病毒特異性GP33+T細(xì)胞中分泌IFN-γ細(xì)胞的比例也顯著升高。這些結(jié)果表明，Arntl敲除后，T細(xì)胞在發(fā)生免疫應(yīng)答的過(guò)程中效應(yīng)功能增強(qiáng)。Arntl對(duì)IFN-γ的影響是否意味著其在Th細(xì)胞的分化過(guò)程中會(huì)促使Th1型細(xì)胞的分化呢？體外誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了分泌IFN-γ細(xì)胞的比例增加。因此，本研究認(rèn)為Arntl敲除一方面促進(jìn)了Th0向Th1分化，輔助CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能；另一方面，Arntl敲除可以促使CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)。因此，IFN-γ的表達(dá)增高可能是敲除鼠病毒清除效率增高的原因。

圖5 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠脾臟中病毒載量測(cè)定

圖6 ArntlF/FCD4cre+和野生型小鼠T細(xì)胞分泌IFN-γ的比例變化

在固有免疫細(xì)胞中，Arntl似乎是抑制炎性反應(yīng)的因子[15-16]，但Arntl如何調(diào)控IFN-γ的表達(dá)尚無(wú)研究報(bào)道。在本研究中，敲除鼠(ArntlF/FCD4cre+)T細(xì)胞分泌IFN-γ顯著增高，其具體機(jī)制需后續(xù)研究闡明。值得注意的是，本研究與HEMMERS[6]用了相似的病毒感染動(dòng)物模型，但是他們的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Arntl對(duì)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的影響，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)研究對(duì)T細(xì)胞的處理是不同的。本實(shí)驗(yàn)在體外采用PDBU和Ionomycin刺激T細(xì)胞4 h后檢測(cè)，而他們采用病毒抗原刺激。

綜上所述，T細(xì)胞中特異性敲除Arntl基因不影響T細(xì)胞的發(fā)育，但在發(fā)生免疫應(yīng)答的過(guò)程中，通過(guò)促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化及CD8+T細(xì)胞IFN-γ的分泌而增強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力。