四種不同傳染性喉氣管炎疫苗免疫應(yīng)激性及保護(hù)性評估

張義冉 李麗華 黃秀英 劉長清

摘? 要：為了篩選出安全、高效的傳染性喉氣管炎疫苗，指導(dǎo)場區(qū)生產(chǎn)，我公司開展A、B、C、D四種傳染性喉氣管炎活疫苗的疫苗效力檢測、免疫后眼部應(yīng)激副反應(yīng)及攻毒試驗等研究。結(jié)果顯示，A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn);C疫苗不適合雞胚效力試驗。眼部應(yīng)激反應(yīng)，C苗應(yīng)激反應(yīng)最小，B、D疫苗次之，A疫苗最嚴(yán)重。攻毒試驗表明，B疫苗免疫0.5羽份不能完全保護(hù)雞群，保護(hù)率為90%，其余疫苗均可100%保護(hù)雞群。綜合結(jié)果表明，C、D兩種傳染性喉氣管炎疫苗免疫0.5羽份效果較好，推薦在該病的流行區(qū)域內(nèi)使用C、D公司的喉氣管炎疫苗0.5羽份用于發(fā)病群和周邊易感雞群的緊急免疫接種。

關(guān)鍵詞：雞傳染性喉炎;喉炎疫苗;免疫效果

中圖分類號：S858.312.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2021）2-0014-06

雞傳染性喉氣管炎（ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）引起的一種急性、接觸性呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)為伸頸張口呼吸、咳嗽和咳出血樣的滲出物[1]，剖檢癥狀為喉頭、氣管粘膜腫脹、出血和糜爛。本病傳播快，死亡率較高，可引起雞群死亡增加和產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[2]。

病雞、康復(fù)帶毒雞以及病毒污染物是本病的主要傳染源，病毒主要通過呼吸道和眼結(jié)膜進(jìn)行傳播。為了有效控制本病的發(fā)生，本病流行地區(qū)通常選擇雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗進(jìn)行免疫接種。本病毒只有一個血清型，但不同毒株的致病性和抗原性稍有差異，一些疫苗可造成雞群很大的免疫應(yīng)激，嚴(yán)重影響雞群精神、采食、飲水、體重等各項指標(biāo)。目前市售的疫苗有多種，但毒力和免疫效果有一定的差異，本試驗通過疫苗效力測定，對雞群分別免疫不同的傳染性喉氣管炎疫苗，觀察免疫后各組雞群的應(yīng)激性、免疫效果（攻毒保護(hù)情況）來進(jìn)行綜合評估，為臨床生產(chǎn)篩選安全、高效的傳染性喉氣管炎疫苗。

1? 材料與方法

1.1? 試驗雞群? 80只40日齡健康京粉2號雞，隨機(jī)分為8個試驗組，每組各10只，每只雞佩戴翅號;20只SPF雞作為陰性及陽性對照，每組各10只，分別飼養(yǎng)于不同的隔離器中。

1.2? 疫苗來源? A、B、C、D四種傳染性喉氣管炎活疫苗，分別來自不同生產(chǎn)廠家。

1.3? 攻毒用毒株? 毒株為2019年山東流行毒株，病毒效價為105.0 EID50/0.1 mL。

1.4? 試驗分組及處理

1.4.1? 疫苗效力檢測? 將各組疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成每1.0 mL含5羽份，再繼續(xù)作10倍倍比稀釋，取10-2、10-3、10-4? 3個稀釋度，經(jīng)絨毛尿囊膜途徑分別接種11日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每胚0.1 mL。每日照蛋一次，將死胚取出標(biāo)記死亡時間，放入4 ℃冰箱冷藏，待試驗結(jié)束一并進(jìn)行判定，接種后24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去不計。雞胚絨毛尿囊膜呈明顯增厚、有灰白色病斑時，判為感染，計算EID50，每羽份病毒含量應(yīng)不低于102.7 EID50。

1.4.2? 雞群分組及免疫? 試驗總共分為10組，其中A、B、C、D? 4個疫苗試驗組，每個疫苗組分2個小組，免疫羽份分別為0.5羽份和1羽份，免疫劑量均為0.1 mL，免疫方法為點(diǎn)眼;2個對照組均不免疫：陽性對照組后期進(jìn)行攻毒，陰性對照組不做任何處理。

1.4.3? 攻毒保護(hù)試驗? 在雞群免疫后27 d（67日齡）進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗。攻毒方法：將毒株進(jìn)行10倍稀釋，試驗組和陽性對照組每只雞進(jìn)行喉頭滴注法攻毒0.2 mL; 而陰性對照組5只雞，注射毒株稀釋液0.2 mL/只，剩余5只不做任何處理。

1.5? 檢測指標(biāo)

1.5.1? 免疫后眼部應(yīng)激副反應(yīng)? 免疫后10 d，每天觀察雞只的精神狀態(tài)、飲水、采食變化、呼吸道癥狀以及雞的眼睛變化等。根據(jù)雞群免疫后的臨床癥狀將病變分為六級，制定相應(yīng)打分標(biāo)準(zhǔn)：- +：眼部輕微炎癥（0.5分）;+：眼窩周圍腫 （1 分）;++：流淚，眼窩周圍紅腫（2分）;+++：眼窩紅腫嚴(yán)重，腫頭（3分）;++++：眼瞼粘連（4分）; +++++：呼吸道癥狀（5分）;對免疫后雞群的應(yīng)激副反應(yīng)進(jìn)行記錄并打分。

1.5.2? 攻毒保護(hù)試驗? 喉炎疫苗免疫后27 d，各組每只雞氣管內(nèi)注射雞傳染性喉氣管炎強(qiáng)毒株0.2 mL（病毒效價為105.0 EID50/0.1 mL），持續(xù)觀察10 d。每天觀察各組雞群眼部變化，記錄死亡剖檢情況，在試驗結(jié)束后將全部病料進(jìn)行PCR檢測。

2? 試驗結(jié)果

2.1? 疫苗檢測? 疫苗毒力檢測結(jié)果見表1。

由表1可見，全程只有B疫苗以10-2稀釋倍數(shù)在接種后96 h雞胚死亡一枚;A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結(jié)果分別為103.7 EID50、103.5 EID50和103.3 EID50，均高于國標(biāo)102.7 EID50，符合標(biāo)準(zhǔn);C疫苗雞胚效力為101.9 EID50，低于國標(biāo)，效力檢測不合格。

2.2? 免疫應(yīng)激反應(yīng)

2.2.1? 應(yīng)激反應(yīng)過程? 各試驗組雞只免后眼部均出現(xiàn)較明顯的應(yīng)激反應(yīng)，平均在免后第4天眼部開始有輕微反應(yīng)，到免后第5天眼瞼粘連最為嚴(yán)重，嚴(yán)重狀態(tài)維持4 d，免后第9天雞只開始逐漸好轉(zhuǎn)，到免后14 d基本恢復(fù)正常。每組試驗雞具體應(yīng)激反應(yīng)情況見表2，應(yīng)激反應(yīng)過程見圖1。

2.2.2? 應(yīng)激反應(yīng)匯總對比? 將免疫后每組雞群具體的應(yīng)激反應(yīng)按照評分標(biāo)準(zhǔn)評分，每組具體評分結(jié)果見表3。應(yīng)激反應(yīng)合計評分的結(jié)果從輕微到嚴(yán)重排序為C

2.3? 攻毒保護(hù)試驗

2.3.1? 雞群精神狀態(tài)變化? 試驗結(jié)果顯示，在免疫組攻毒后第2天，雞只開始出現(xiàn)炸毛、精神沉郁等現(xiàn)象;攻毒后第4天，雞只炸毛現(xiàn)象減輕，B-0.5羽份組雞只死亡1只;攻毒后第5天，雞只狀態(tài)開始好轉(zhuǎn);攻毒后第7天，A組疫苗雞只炸毛現(xiàn)象比較嚴(yán)重。

陽性對照組雞只在攻毒后24 h內(nèi)無明顯異常;攻毒后第2天，有的雞只出現(xiàn)精神沉郁、打蔫、炸毛、甩頭等臨床癥狀;攻毒后第3天，隔離器內(nèi)出現(xiàn)血跡;攻毒后第4天雞只開始有死亡，攻毒后共死亡4只。

2.3.2? 剖檢和實驗室診斷結(jié)果

2.3.2.1? 死亡雞只剖檢及PCR檢測結(jié)果? 陽性對照組雞只在攻毒后第4、5、6、8天各死亡1只（共4只），B-0.5羽份組在攻毒后第4天死亡1只;陽性對照組雞只死亡前出現(xiàn)典型臨床癥狀，如眼睛流淚、眼瞼腫脹、粘連、伸頸呼吸、咳血等現(xiàn)象。剖檢表現(xiàn)為喉頭、氣管附著粘液和黃色干酪物且容易剝離等變化。雞只臨床癥狀、實驗室診斷結(jié)果與傳染性喉氣管炎病理變化和癥狀相符。具體結(jié)果見表4和圖2。

2.3.2.2? 未死亡雞只剖檢及PCR檢測結(jié)果? 陽性對照組：除個別雞只外，其它雞只剖檢均有明顯的病理變化，如喉頭氣管附著粘液和干酪物、肺病變、脾腫大等，且PCR結(jié)果均為陽性。免疫組：雞只無喉炎典型的病理變化，實驗室診斷結(jié)果顯示PCR結(jié)果均為陰性。

2.4? 綜合試驗結(jié)果? 各組試驗結(jié)果匯總情況見表5。

結(jié)果顯示：疫苗效價評估部分，A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn);C疫苗檢測結(jié)果不符合標(biāo)準(zhǔn);免后應(yīng)激部分，攻毒后眼部應(yīng)激反應(yīng)由輕到重的排序為C-0.5羽份

3? 討論

雞傳染性喉氣管炎對我國養(yǎng)禽業(yè)危害較大，該病自從1965年在國內(nèi)首次報道以來，已在全國范圍內(nèi)蔓延，發(fā)病例數(shù)逐年增加。由于該病的病原雞傳染性喉氣管炎病毒屬于皰疹病毒，能夠在雞體內(nèi)長期潛伏，受到某些刺激后能夠大量復(fù)制并排毒從而引發(fā)疾病，增大了該病防控的難度[3-4]。康復(fù)帶毒雞和疫苗接種雞可長期帶毒，并向外界不斷排毒，是主要的傳染源[5]，因此，在疫區(qū)內(nèi)及受威脅地區(qū)的雞群必須將ILT免疫列入免疫程序，對5周齡以上的雞進(jìn)行免疫，并做好雞場的隔離和安全防護(hù)，非疫區(qū)及5周齡以下雞群免疫應(yīng)謹(jǐn)慎[6]。

本次試驗的毒株選用的是2019年山東分離的高致病性傳染性喉氣管炎毒株，病毒效價為105.0 EID50/0.1 mL，陽性對照組雞群在攻毒后10 d內(nèi)共死亡4只，且剖檢病料PCR檢測結(jié)果均為陽性，表明該毒株可100%導(dǎo)致雞群發(fā)病。

疫苗效力檢測結(jié)果顯示，A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結(jié)果均高于國標(biāo)102.7 EID50，符合標(biāo)準(zhǔn);C疫苗雞胚效力檢測不合格，但C為細(xì)胞苗，不適合雞胚效力檢測。

目前對 ILTV 最有效的預(yù)防方法還是疫苗接種，其中點(diǎn)眼是最好的免疫方法[7]?，F(xiàn)有傳染性喉氣管炎疫苗一般是減毒疫苗，但也會表現(xiàn)出減毒不完全，往往接種疫苗后表現(xiàn)一定的病理損傷（如產(chǎn)生不同程度的眼結(jié)膜炎，一般1～2周后恢復(fù)）[8]。劉興彩[9]研究表明在使用傳染性喉氣管炎疫苗1羽份以下的免疫劑量進(jìn)行免疫時，雞群的免疫副反應(yīng)相對較小，而且雞群在 5 d內(nèi)即可恢復(fù);但本研究數(shù)據(jù)表明，整體來看，A、B、C、D疫苗0.5羽份和1羽份組雞群平均在免后第4天開始有輕微反應(yīng)，到免后第5天眼瞼粘連最為嚴(yán)重，嚴(yán)重癥狀維持4 d左右，免后第9天雞只開始逐漸好轉(zhuǎn)，到免后14 d雞只基本恢復(fù)正常。各試驗組應(yīng)激反應(yīng)由輕到重排序為C-0.5羽份

本研究攻毒保護(hù)試驗結(jié)果顯示，攻毒10 d后，陽性對照組雞群死亡4只，且病料PCR檢測結(jié)果均為陽性，B-0.5羽份疫苗免疫組于攻毒后第4天死亡1只，且病料PCR檢測結(jié)果為陽性，其余組別無死亡，表明B疫苗免疫0.5羽份不能完全保護(hù)雞群，保護(hù)率為90%;其余疫苗均可100%保護(hù)雞群。劉興彩[9]喉炎免疫攻毒試驗研究結(jié)果表明，0.2 羽份以上的免疫劑量可對雞群產(chǎn)生較好的保護(hù)力，但隨著免疫劑量的增大，免疫反應(yīng)逐漸加重，因此結(jié)合本試驗結(jié)果建議每只雞進(jìn)行傳染性喉氣管炎疫苗免疫時可應(yīng)用 0.5 羽份的劑量。

從喉炎疫苗的效力檢測、疫苗免疫后的應(yīng)激反應(yīng)到攻毒后的免疫保護(hù)試驗結(jié)果顯示，C、D兩種傳染性喉氣管炎疫苗免疫0.5羽份效果較好，推薦在該病的流行區(qū)域內(nèi)使用C、D公司的喉氣管炎疫苗0.5羽份，以用于發(fā)病群和周邊易感雞群的緊急免疫接種。

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