日糧中添加桑葉多糖對(duì)雛雞免疫功能的影響

耿兵 臧云飛 王照紅 李福偉 趙東曉 董亞茹 高金波

摘? 要：為了探明桑葉多糖對(duì)雛雞免疫功能的影響，本研究采用超聲波輔助水提法，輔以離子交換柱層析對(duì)其純化，得到兩種不同分子量的桑葉多糖組分（ MLP-I、MLP-II） 。將兩種多糖分別以0.5%的劑量添加到雛雞的基礎(chǔ)日糧中。結(jié)果表明，桑葉多糖可以顯著提高雛雞免疫器官指數(shù)，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，MLP-II的免疫增強(qiáng)效果優(yōu)于MLP-I。本研究為桑葉多糖的開(kāi)發(fā)利用提供了技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑葉多糖;雛雞;免疫

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.75? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2021）2-0010-04

多糖是普遍存在于植物體內(nèi)的生物學(xué)大分子物質(zhì)，具有提高機(jī)體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗炎等一系列作用，近年來(lái)關(guān)于植物多糖的研究較為廣泛。桑葉是?？贫嗄晟淙~小喬木桑樹(shù)（Morus alba L.）的葉，中醫(yī)又稱(chēng)“鐵扇子”[1]，桑葉中含有植物甾醇、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、多糖等功能性活性物質(zhì)，其多糖成分具有提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、抗氧化 、降血糖、降血脂、抗高血壓、抗炎和血管舒張劑等多種生物活性[2-7]。侯瑞宏等研究發(fā)現(xiàn)，桑葉多糖（MLP）對(duì)小鼠的體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、細(xì)胞免疫功能等均有顯著性的影響，說(shuō)明MLP具有免疫調(diào)節(jié)功能[8]。因此，本研究將桑葉經(jīng)提取、分離、純化得到兩種不同分子量的多糖組分（MLP-I、MLP-II），并將兩種不同的多糖組分作用于雛雞，探討桑葉多糖對(duì)雛雞免疫功能的影響，為桑葉多糖在家禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1? 材料? 細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司;200只1 d海蘭褐公雛，購(gòu)自于海陽(yáng)鴻牧種禽有限公司;酶標(biāo)儀（ELX800），美國(guó) Bio-Tek 寶特公司產(chǎn)品;臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16G），上海安亭科學(xué)儀器制造廠生產(chǎn);超聲波清洗?。↘Q-2200DB），昆山股份有限公司生產(chǎn);其它試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2? 桑葉粗多糖的提取? 采用超聲波輔助水提法，具體步驟如下：新鮮桑葉在真空烘箱中60 ℃烘干，研磨過(guò)80目篩， 制成桑葉干粉。純凈水為溶劑，料液比1∶20，超聲波功率為50 W，85 ℃提取時(shí)間2.5 h[9]，將濾液在真空下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50 ℃下濃縮，無(wú)水乙醇沉淀，真空冷凍干燥，得到的粉末即為桑葉粗多糖。

1.3? 桑葉多糖的純化? 將粗制MLP溶解于10 mL蒸餾水中，通過(guò)0.45 mMMPs膜過(guò)濾。濾液通過(guò)DEAE-52纖維素陰離子交換柱（26 mm×500 mm）。洗脫液為0.1 mol/L NaCl，流速為1 mL/min。洗脫液的總糖含量用苯酚-硫酸法測(cè)定。NaCl洗脫的餾分在Sephadex G-100凝膠柱上以0.5 mL/min的速度洗脫，洗脫峰的洗脫液裝入透析袋中進(jìn)一步純化濃縮，最后經(jīng)乙醇沉淀、真空冷凍干燥得到純化多糖[10]。

1.4? 試驗(yàn)動(dòng)物及分組? 將200只1 d海蘭褐公雛飼養(yǎng)至7 d后選取150只，隨機(jī)分為3組（MLP-I組、MLP-II組和空白對(duì)照組）。試驗(yàn)組在雛雞的基礎(chǔ)日糧中添加0.5%的桑葉多糖。常規(guī)飼養(yǎng)管理，各組的飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)方法等均一致。試驗(yàn)期56 d，預(yù)試期5 d。

1.5? 檢測(cè)指標(biāo)和方法? 試驗(yàn)56 d時(shí)，每組隨機(jī)選取30只試驗(yàn)雞心臟采血，分離血清檢測(cè)免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白介素2（IL-2）和γ-干擾素（IFN-γ）含量;禁食12 h后稱(chēng)重、屠宰，取胸腺、脾臟、法氏囊和肝臟等免疫器官，吸干表面液體、除去多余脂肪，稱(chēng)其鮮重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮重（g）/宰前空腹活重（kg）。

1.6? 數(shù)據(jù)分析? 數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2007 和SAS （Version 8e，SAS Institute，1998）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 桑葉多糖的分離提純? 苯酚-硫酸法檢測(cè)結(jié)果表明，桑葉多糖的提取率達(dá)到8.83%，多糖的純度為86.97%。用葡聚糖凝膠柱Sephadex G-100層析純化桑葉多糖，得到兩種多糖組分，分別命名為MLP-I、MLP-II，如圖1所示。

2.2? MLP對(duì)雛雞免疫器官發(fā)育的影響? 結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，兩種桑葉多糖組分可以顯著提高雛雞胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)（P<0.05），MLP-II效果優(yōu)于MLP-I，兩種多糖對(duì)雛雞脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。

2.3? MLP對(duì)雛雞血清中細(xì)胞因子的影響? 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，兩種桑葉多糖組分對(duì)雛雞血清中免疫球蛋白IgG、IgM的分泌沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用;MLP-II、MLP-I均可顯著提高血清中IL-2和IFN-γ的含量（P<0.05）。

3? 討論

多糖是桑葉中的重要活性物質(zhì)，具有顯著的抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功能[11]。多糖主要是利用其結(jié)構(gòu)相似性和受體結(jié)合發(fā)揮生物活性，調(diào)節(jié)免疫器官釋放相關(guān)細(xì)胞活性因子，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力[12]。胸腺和法氏囊是家禽重要的免疫器官，是多種免疫活性因子分泌的主要部位[13]，免疫器官的發(fā)育狀態(tài)與免疫功能密切相關(guān)。Ravis等人報(bào)道稱(chēng)免疫器官指數(shù)可以用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫水平，較大的免疫器官重量通常在一定程度上代表著較強(qiáng)的免疫功能[14]。因此免疫器官指數(shù)常用來(lái)評(píng)價(jià)家禽的免疫水平[15]。

本研究純化的桑葉多糖組分MLP-II、MLP-I對(duì)胸腺和法氏囊的發(fā)育均具有促進(jìn)作用，說(shuō)明桑葉多糖對(duì)雛雞的免疫具有促進(jìn)作用。這與目前的研究結(jié)果相似，陳洪亮[16]研究結(jié)果表明，黃芪多糖、牛膝多糖、蘆薈多糖能夠顯著提高肉雞的法氏囊指數(shù);李維[17]研究結(jié)果表明，桑葉多糖能夠有效增強(qiáng)小鼠的機(jī)體免疫力;張燕等[18]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)白毛藤多糖能夠顯著提高三黃雞雛雞的免疫器官指數(shù)。

血清中IL-2、IFN-γ也是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，日糧中添加桑葉多糖可顯著提高雛雞血清中IL-2和IFN-γ含量，通過(guò)提高細(xì)胞免疫因子增加機(jī)體血液屏障功能，從而提高機(jī)體的免疫防御。這與Chen等[10]研究結(jié)果相似，即桑葉多糖能顯著促進(jìn)小鼠空腸和氣管分泌IL-2、IFN-γ和SIgA，促進(jìn)盲腸扁桃體IgA+細(xì)胞的產(chǎn)生，增強(qiáng)腸道和氣管粘膜免疫功能;Fan等[19]將淫羊藿多糖作為疫苗免疫佐劑，發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖能夠最有效地促進(jìn)IFN-γ和IL-6 的分泌。說(shuō)明多糖能夠通過(guò)增加細(xì)胞因子分泌，可能激活了相關(guān)免疫應(yīng)答通路，進(jìn)而提高機(jī)體免疫水平。

4? 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助水提法提取桑葉多糖，利用凝膠柱子層析得到兩種不同分子量的桑葉多糖組分MLP-I、MLP-II，并分析其對(duì)雛雞的免疫功能影響，發(fā)現(xiàn)MLP-I、MLP-II均可以顯著提高雛雞的免疫功能，MLP-II的效果好于MLP-I，為繼續(xù)開(kāi)發(fā)利用桑葉多糖奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 蘇方華. 桑葉的化學(xué)成分及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（14）： 9-12.

[2]? Arumugam S， Mito S， Thandavarayan R A， et al. Mulberry leaf diet protects against progression of experimental autoimmune myocarditis to dilated cardiomyopathy via modulation of oxidative stress and MAPK-mediated apoptosis[J]. Cardiovascular therapeutics， 2013， 31（6）： 352-362.

[3]? 姚佳， 喬迪， 郭鑫， 等.桑葉中1-脫氧野尻霉素對(duì)糖尿病腎病大鼠的治療作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2018， 23（5）：517-523.

[4]? Ren C， Zhang Y， Cui W， et al. A polysaccharide extract of mulberry leaf ameliorates hepatic glucose metabolism and insulin signaling in rats with type 2 diabetes induced by high fat-diet and streptozotocin[J]. Int J Biol Macromol， 2015， 72（9）： 951-959.

[5]? Yang N C，Jhou K Y，Tseng C Y. Antihypertensive effect of mulberry leaf aqueous extract containing γ- aminobutyric acid in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry， 2012， 132（4）： 1796-1801.

[6]? Horng C T， Liu Z H， Huang Y T， et al. Extract from Mulberry（Morusaustralis） leaf decelerate acetaminophen induced hepaticinflammation involving downregulation of myeloid differentiation factor 88 （MyD88） signals[J]. Journal of Food and Drug Analysis， 2017， 25（4）： 862-871.

[7]? Kurniati N F， Suryani G P， Sigit J I. Vasodilator effect of ethanolicextract of mulberry leaves （Morus alba L.） in rat and rabbit[J].Procedia Chemistry， 2014， 13： 142-146.

[8]? 侯瑞宏，廖森泰，劉凡，等.桑葉多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響[J].食品科學(xué)，2011，32（13）：280-283.

[9]? 劉學(xué)軍，李云平，胡恒彬，等.超聲波提取桑葉多糖工藝條件優(yōu)化[J].北方蠶業(yè)，2007，28（3）：11-13.

[10]? Chen X， Sheng Z， Qiu S， et al. Purification，characterization and in vitro and in vivo immune enhancement of polysaccharides from mulberry leaves[J]. Plos One， 2019，14（1）：1-20.

[11]? 曾衛(wèi)湘，鄭莎，韓冷，等.53份桑種質(zhì)桑葉的藥用品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)[J].蠶業(yè)科學(xué)，2018，44（6）：905-915.

[12]? 何余堂，潘孝明.植物多糖的機(jī)構(gòu)與活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，31（17）：493-496.

[13]? Fan YP，Lu Y，Wang DY， et al.Effect of epimedium polysaccharide-propolis flavone immunopotentiator on immunosuppression induced by cyclophosphamide in chickens[J].Cellular Immunology， 2013， 281：37-43.

[14]? Ravis W R， Parsons D L， Wang S J. Buffer and pH effects on propranolol binding by human albumin and α1-acid glycoprotein[J]. Journal of Pharmacy & Pharmacology， 1988，40， 459-463.

[15]? Heckert R A， Estevez I， Russek-Cohen E， Pettit-Riley R. Effects of density and perch availability on the immune status of broilers[J]. Poultry Science， 2002，81： 451-457.

[16]? 陳洪亮.植物多糖的制備及對(duì)肉仔雞免疫功能影響的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2002.

[17]? 李維.桑葉多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響[J].江西農(nóng)業(yè)，2016（13）：110-111.

[18]? 張燕，孫志良，陳小軍.從組織學(xué)角度研究白毛藤多糖對(duì)雞免疫器官的影響[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2007（8）：26-27.

[19]? Fan Y，Liu J，Wang D，et al.Adjuvanticity of epimedium polysaccharide-propolis flavone on inactivated vaccines against AI and ND virus[J]. Int J Biol Macromol，2012，51（5）： 1028-1032.

Effects of dietary mulberry leaf polysaccharides

on immune function of chicks

GENG bing1， WANG zhaohong1， LI fuwei1， ZHAO dongxiao1， DONG yaru1， GAO jinbo1，2*

（1.Shandong Sericulture Research Institute，Yantai 264002， China;

2.Institute of Poultry Research，Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Poultry Breeding and Engineering Technology Research Center， Jinan 250100， China）

Abstract：In order to find out the effect of mulberry leaf polysaccharides on the immune function of chicks， ultrasonic-assisted water extraction and ion exchange column chromatography were used to purify mulberry leaf polysaccharides， and two kinds of mulberry leaf polysaccharides with different molecular weight （MLP-I and MLP-II） were obtained. The two polysaccharides were added to the basal diet of chicks at a dose of 0.5% respectively. The results showed that mulberry leaf polysaccharides could significantly increase the immune organ index of chicks and significantly promote the secretion of cytokines IL-2 and IFN- γ. The immune enhancement effect of MLP-II was better than that of MLP-I. This study provides technical support and theoretical basis for the development and utilization of mulberry leaf polysaccharides.

Keywords： Mulberry leaf polysaccharides;chicks;immunity□