當(dāng)歸對(duì)血虛大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響

段樹(shù)麗

（靖遠(yuǎn)縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 靖遠(yuǎn) 730600）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性50只，SPF清潔級(jí)，體重200±20 g。按組分籠飼養(yǎng)，通用飼料喂養(yǎng)，自由飲水，自然光照，溫度20～30℃，適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試劑與材料 水合氯醛、乙酰苯肼（上海中秦化學(xué)試劑有限公司）、注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、ATP酶試劑盒（南京建成生物工程有限公司）、當(dāng)歸樣品采自甘肅岷縣、精密移液器及一次性吸頭、蒸餾水、一次性試管、吸水紙等。

1.1.3 儀器 37℃恒溫箱、酶標(biāo)儀、動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀（南京普朗醫(yī)療器械設(shè)備有限公司）、RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 當(dāng)歸水煎液的制備 稱取生當(dāng)歸240 g，加1 200 ml蒸餾水浸泡1 h，然后煮沸，沸騰后小火繼續(xù)加熱持續(xù)30 min，趁熱過(guò)濾，倒出上清液，剩余濾渣加蒸餾水600 ml，繼續(xù)煮沸20 min，倒出上清液，合并2次上清液，過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至300 ml，然后用蒸餾水定容至400 ml[1]，使其相當(dāng)于含生藥0.6 g/ml（臨用時(shí)以蒸餾水配成所需濃度），置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 動(dòng)物分組與造模 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組大鼠10只，分別為正常對(duì)照組、模型組和當(dāng)歸水煎液高、中、低劑量組。

正常對(duì)照組用灌胃針投服生理鹽水1 ml/0.1 kg，1次/d，連續(xù)9 d，除正常對(duì)照組外，其余各組在試驗(yàn)第2天和第5天，分別皮下注射20 mg/kg、40 mg/kg的C8H10N2O，注射C8H10N2O 5 d后，其余各組每日腹部皮下注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)4 d[2]。當(dāng)歸水煎液高、中、低劑量組（低劑量相當(dāng)于含生藥0.15 g/ml、中劑量相當(dāng)于含生藥0.3 g/ml、高劑量相當(dāng)于含生藥0.6 g/ml）灌胃針投服當(dāng)歸水煎液1 ml/0.1 kg，1次/d，連續(xù)9 d[3]。

1.2.3 取材及處理 各組大鼠分別于末次給藥后2 h水合氯醛麻醉，股動(dòng)脈無(wú)菌取血，檢測(cè)血常規(guī)，主要包括血紅蛋白（HGB）等進(jìn)行計(jì)數(shù)[4]。股動(dòng)脈采血，肝素鈉抗凝，分離血清，按照ATP酶試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)紅細(xì)胞Na+-K+-ATP與Ca2+-Mg2+-ATP兩種酶的活性。ATP酶活性以每小時(shí)分解1×107個(gè)紅細(xì)胞產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷的量表示(單位nmol·10-7·h-1)。

用SPSS軟件中的ANOVA分析正常組和模型組數(shù)據(jù)（p＜0.05），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般體征特征

隨著給藥天數(shù)的增加，除正常對(duì)照組之外，其余各組大鼠口唇或粘膜淡白無(wú)澤，四肢無(wú)力或輕度擅毛，毛發(fā)失澤干枯，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，聚堆，耳、尾顏色蒼白而涼，血呈暗紅，嗜睡，體重下降，模型組更為明顯。解剖后可觀察到正常對(duì)照組肝臟、脾臟、胸腺正常，模型組胸腺明顯萎縮。當(dāng)歸水煎液不同劑量組各種免疫器官不同程度淤血，顏色不同程度加深。

2.2 當(dāng)歸水煎液對(duì)血虛大鼠血常規(guī)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血象顯著降低(p＜0.01)，說(shuō)明利用乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合造模成功。通過(guò)分析、比較發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸水煎液不同劑量對(duì)大鼠影響不同，詳細(xì)情況見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸水煎液對(duì)血虛大鼠血象的影響x±s

表2 當(dāng)歸水煎液對(duì)大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響x±s

2.3 當(dāng)歸水煎液對(duì)大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠紅細(xì)胞膜兩種酶活力Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP均顯著降低。當(dāng)歸水煎液高、中、低劑量組紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯高于模型組和生理鹽水對(duì)照組(p＜0.05)。詳見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 血虛模型的建立

有文獻(xiàn)報(bào)道[5]中醫(yī)血虛模型建立常用的方法主要有乙酰苯肼[6]、環(huán)磷酰胺[7]等幾種造模方法。在中醫(yī)證型研究中乙酰苯肼誘導(dǎo)血虛模型在血虛動(dòng)物模型的制作中具有代表性，相關(guān)研究多且已成熟。乙酰苯肼是一種強(qiáng)氧化劑，可干擾紅細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性，使機(jī)體出現(xiàn)溶血性貧血，紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血紅蛋白明顯減少。試驗(yàn)觀察到注射乙酰苯肼后次日，大鼠即表現(xiàn)精神萎靡，神疲乏力，易驚，行動(dòng)遲緩，團(tuán)縮弓腰，口唇、眼瞼、耳廓蒼白，易脫毛，毛蓬豎少光澤，飲水多，進(jìn)食減少，大便干黑而少等貧血癥狀。

本試驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺和乙酰苯肼聯(lián)合應(yīng)用造模，研究當(dāng)歸對(duì)血虛模型的改善作用。環(huán)磷酰胺作為細(xì)胞毒藥物，損傷外周血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、白細(xì)胞，對(duì)后者損傷更明顯。乙酰苯肼能損傷紅細(xì)胞，兩者聯(lián)用對(duì)血液系統(tǒng)損傷更大，大鼠皮下注射兩種藥能較好地反映中醫(yī)血虛的癥候。隨著環(huán)磷酰胺和乙酰苯肼用量的增加，各組大鼠呈現(xiàn)不同程度的精神萎靡，毛色失去光澤。當(dāng)歸能夠改善化學(xué)物質(zhì)所致血虛小鼠的造血功能，同時(shí)具有一定的免疫增強(qiáng)功能，從而達(dá)到扶正固本功效，但其補(bǔ)血和促進(jìn)免疫功能的機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

3.2 當(dāng)歸對(duì)血虛大鼠外周血象的影響

本試驗(yàn)中乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合造模使模型組大鼠的紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量均顯著降低，當(dāng)歸水煎液高、中、低劑量組能顯著提高血虛大鼠RBC、WBC、HGB水平(p＜0.01)。乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用成功造成大鼠血虛，當(dāng)歸具有良好的補(bǔ)血作用。

3.3 當(dāng)歸對(duì)血虛大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP是細(xì)胞膜上重要的酶蛋白，這兩種蛋白酶基因起源相同，此外還有相似的結(jié)構(gòu)功能，能主動(dòng)將Ca2+、Na+運(yùn)送到細(xì)胞外，攝入Mg2+、K+。Na+-K+-ATP酶是將細(xì)胞膜內(nèi)Na+移到細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的K+移入膜內(nèi)，從而形成兩種離子的分布不平衡；Ca2+-Mg2+-ATP酶的作用是將Mg2+移入胞內(nèi)，將Ca2+移到細(xì)胞外，維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。血虛模型使能量代謝和離子平衡被破壞，形成膜離子泵功能障礙，導(dǎo)致ATP減少、細(xì)胞內(nèi)外離子分布異常，通過(guò)增加ATP酶的活性調(diào)節(jié)離子分布、改善機(jī)體能量代謝、保護(hù)機(jī)體免受損傷 。

本試驗(yàn)中模型組紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯低于空白對(duì)照組（p＜0.05），模型組紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著性降低（p＜0.01），說(shuō)明血虛造模型成功 。試驗(yàn)表明當(dāng)歸水煎液可增強(qiáng)乙酰苯肼與環(huán)磷酰胺致大鼠血虛模型機(jī)體的能量代謝。