三陰性乳腺癌中間質-上皮細胞轉化因子及脂肪酸合成酶的表達情況及對預后的影響

蔣威華, 伊麗娜, 張晨光, 雪來提·派祖拉, 許文婷, 歐江華

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺外科二病區(qū), 新疆 烏魯木齊, 830011)

乳腺癌是女性最常見惡性疾病，手術治療、放化療、內分泌治療、靶向治療和免疫治療療效顯著，但仍有部分患者出現(xiàn)原發(fā)性耐藥和復發(fā)轉移[1]。三陰性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中最具侵襲性的亞型，目前治療手段較少，與非三陰性乳腺癌患者比較，預后極差[2-3], 至今仍不能采用單因素或多因素模型來完全解釋其發(fā)生及發(fā)展機制，因此生物學預后因子對TNBC的預后判斷和臨床治療具有重要作用。間質-上皮細胞轉化因子(c-Met)屬于酪氨酸激酶受體家族(RTKS)成員，與其配體肝細胞生長因子(HGF)相結合后，可激活下游信號傳導通路，參與腫瘤細胞生長、增殖、轉移等重要生物學活動[4-5]。研究[6]顯示, MET陽性TNBC患者總生存期較短，其死亡風險是陰性患者的1.779倍，而針對c-Met陽性的TNBC患者靶向治療時應聯(lián)合MET和表皮生長因子受體(EGFR)才能獲益更大。研究[7]發(fā)現(xiàn)，脂肪酸合成酶(FASN)在乳腺癌患者中表達水平越高，腫瘤惡性程度越高，腫瘤復發(fā)、轉移及患者死亡的風險越高[8]。TNBC患者中，聯(lián)合抑制FASN和EGFR的活性可起到協(xié)同增強抗腫瘤作用，因此封鎖FASN和EGFR靶點在TNBC臨床治療模式中，是一個新的治療方向[9]。本研究檢測c-Met及FANS在TNBC中的表達，探討c-Met及FANS與TNBC患者臨床病理特征的關系及其對預后的影響，對與EGFR有協(xié)同抗腫瘤作用兩項指標進行聯(lián)合檢測，以期為此類患者進行更精確的預后判斷并提供可能的治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013—2015年在新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科行手術切除且術后常規(guī)病理檢查確診為TNBC的218例女性患者的臨床資料，年齡27～71歲，中位年齡46歲，分別選取患者癌組織及癌旁組織。納入標準: ① 首次治療并可實施手術的患者; ② 雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER2)表達均為陰性的浸潤性乳腺癌患者; ③ 有完整病理資料及隨訪資料者。排除標準: ① ER、PR、HER2表達均為陰性的原位癌患者; ② 非三陰性浸潤性乳腺癌患者。

1.2 實驗方法

采用免疫組織化學染色法(SP)檢測c-Met蛋白及FASN蛋白表達水平，免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋, 4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟，經(jīng)梯度酒精水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH值=7.4)浸洗5 min, 反復浸洗3次，然后高溫、高壓抗原修復1 min, 蒸餾水沖洗3 min, 反復沖洗2次，再用PBS沖洗3次，每次2 min, 切片置于濕盒中，每張切片滴加過氧化氫甲醇溶液50 mL, 室溫下(約20 ℃)孵育10 min，封閉內源性過氧化酶活性，采用PBS沖洗3次，每次5 min; 滴加第一抗體, c-Met稀釋度為1∶200, FASN為1∶100, 孵育4 ℃過夜, PBS沖洗5 min, 反復3次; 滴加檢測試劑，室溫下孵育30 min, 最后再用PBS沖洗3次，每次5 min; 滴加顯色試劑，蘇木素復染，脫水，分色，以PBS代替一抗做陰性對照，以選取的乳腺癌組織切片做陽性對照。

1.3 c-Met及FANS表達結果判讀標準

c-Met蛋白主要存在于胞膜上，由2名病理科醫(yī)師采取雙盲觀測，將陽性細胞占比和細胞染色強度作為綜合判斷標準。陽性細胞染色占比計分標準: 陰性為0分，陽性細胞占比<25%計1分, 25%～50%計2分, >50%～75%計3分, >75%計4分; 染色強度計分標準: 無染色為陰性計0分，淡黃色為弱陽性計1分，深黃色為中陽性計2分，棕褐色為強陽性計3分。2項指標相加得分≤4分為陰性，>4分為陽性。

FANS陽性表達為胞漿染色棕色，將標本切片的染色強度和陽性細胞染色占比分別記分后相加，所得分數(shù)即為最后評分。染色強度評分判定標準: 染色不顯色為0分，染色呈淺棕色為1分，染色呈棕色為2分，染色呈深棕色為3分; 陽性細胞染色占比計分標準: 陽性細胞染色占比≤1%為0分, >1%～10% 為1分, >10%～50% 為2分, >50%～80%為3分, >80%為4分。總分<4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.4 隨訪

本研究隨訪時間自術后開始計算，隨訪截至2020年5月，主要生存期評估指標為5年無瘤生存時間(DFS)。DFS指從術后第1天至腫瘤局部復發(fā)、區(qū)域性復發(fā)或遠處轉移的時間; 局部復發(fā)指乳腺癌術后同側乳腺或胸壁再次出現(xiàn)同一性質腫瘤; 區(qū)域性復發(fā)指乳腺癌區(qū)域淋巴結(腋窩、鎖骨上/下及內乳淋巴結)清掃術后再次出現(xiàn)腫瘤; 遠處轉移指乳腺癌術后，腫瘤細胞通過任一轉移途徑轉移到遠離原發(fā)部位的組織和器官，并生長出同一性質腫瘤。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗, Kaplan-Meier法進行生存分析，并使用Log-rank檢驗比較組間生存曲線差異，本研究所有檢驗水準均取α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 c-Met及FASN在TNBC癌組織中的表達情況及其與臨床病理特征的關系

218例TNBC組織中, c-Met蛋白陽性表達130例，陽性率59.6%; 癌旁組織中, c-Met蛋白陽性表達65例，陽性率29.8%。c-Met在癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。FASN陽性表達142例(65.1%), 癌旁組織中陽性表達30例(13.8%), TNBC癌組織中FASN陽性表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 c-Met及FASN在TNBC癌組織及癌旁組織中

卡方檢驗結果顯示，腋窩淋巴結轉移患者的 c-Met及FASN陽性表達率高于腋窩淋巴結未轉移者，臨床分期Ⅲ期患者陽性表達率高于Ⅰ期患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 但與腫瘤直徑無關(P>0.05)。合并糖尿病患者中, FASN陽性表達率高于無糖尿病患者，且體質量指數(shù)越高, FASN的陽性表達率也越高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而c-Met的陽性表達與糖尿病及體質量指數(shù)無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 c-Met及FASN在TNBC組織的表達及與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.2 c-Met及FASN陽性表達的TNBC患者生存情況分析

218例患者中, 54例(24.8%)出現(xiàn)復發(fā)轉移，復發(fā)轉移患者及未復發(fā)轉移患者的c-Met及FASN表達情況見表3。

表3 TNBC患者復發(fā)遠處轉移情況[n(%)]

統(tǒng)計結果顯示, c-Met及FASN陽性表達患者的5年無瘤生存率均低于陰性表達患者(P<0.05)。130例c-Met陽性和88例陰性患者5年無瘤生存率分別為70.0%和82.9%。c-Met陽性和陰性表達患者的生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1。

圖1 c-Met表達與TNBC患者無瘤生存率關系

142例FASN表達陽性患者5年復發(fā)轉移42例, 5年無瘤生存率為70.4%; 76例FASN陰性表達患者中復發(fā)轉移12例，5年無瘤生存率為84.2%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2。

圖2 FASN表達與TNBC患者無瘤生存率的關系

3 討 論

c-Met是原癌基因c-Met編碼的蛋白，編碼該受體的基因位于7號染色體7q21-q31上，屬于酪氨酸激酶受體家族(RTKS)成員，主要存在于上皮細胞的胞膜上[4], 可促進腫瘤組織新血管形成、淋巴管生成、腫瘤細胞增殖分化、抵抗腫瘤細胞凋亡等，影響惡性腫瘤浸潤和晚期遠處轉移[10]。研究[11-13]發(fā)現(xiàn), c-Met在結腸癌、胰腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤浸潤、復發(fā)和晚期遠處轉移中起著至關重要作用。

本研究結果顯示, 218例TNBC癌組織中c-Met蛋白陽性表達130例，陽性表達率為59.6%, TNBC癌組織中c-Met蛋白陽性表達率高于癌旁組織，與ZAGOURI F等[14]研究結果相近，且c-Met陽性率隨著TNBC組織學分級與TNM分期的增加而增高，腋窩淋巴結轉移患者的c-Met陽性率高于腋窩淋巴結未轉移患者，表明c-Met高表達與癌細胞的侵襲性及增殖活力有關，但具體機制還需進一步研究。生存分析顯示, c-Met陽性的TNBC患者預后較差。c-Met蛋白表達陽性在多項研究[15]中被證明是乳腺癌預后不良的因素。一項薈萃分析[16]結果顯示, c-Met蛋白高表達在各亞型乳腺癌患者中均有較差的總生存期(OS)及DFS, 可作為判斷乳腺癌患者預后的重要指標。研究[17]認為, c-Met的表達與TNBC關系密切, c-Met陽性的TNBC患者有較低的無瘤生存率和OS, 推測c-Met蛋白高表達在TNBC細胞的增殖、進展及轉移中起著重要作用，但如果要將c-Met作為腫瘤治療靶點，還應考慮TNBC中EGFR的表達狀態(tài)。研究[18]表明，TNBC患者聯(lián)合表達Met和EGFR的患者無病生存情況顯著差于只表達EGFR的患者，因此TNBC的靶向治療應聯(lián)合Met和EGFR才能使其治療獲益。

FASN是脂肪酸合成的關鍵酶，位于細胞胞漿內，是一種二聚體蛋白，具有多種酶活性[19]。FASN在多種惡性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，而在正常組織中不表達或低表達。研究[20]顯示, FASN表達水平與乳腺腫瘤惡性程度關系密切，且對預后有一定的判斷作用。

本研究FASN在TNBC癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，同時, FASN的表達狀態(tài)與患者腋窩淋巴結轉移、組織學分級、2型糖尿病及肥胖有關(P<0.05)，這與相關研究[21]結果相符。FONTANELLA C等[22]研究結果顯示，與非肥胖患者相比，肥胖TNBC患者中，體質量指數(shù)越高，生存期越短，因此肥胖是影響患者預后的一項危險因素。肥胖患者就診時腫瘤直徑較大，淋巴結分期和臨床分期較高，腫瘤侵襲性更強，最終可導致較差的預后[23]。本研究隨訪結果顯示，F(xiàn)ASN在TNBC組織中陽性表達患者預后較陰性表達患者預后差。研究發(fā)現(xiàn)，高表達FASN可導致耐藥的發(fā)生，降低FASN表達可增強化療藥物的敏感性[24]，TNBC組織中FASN高表達致化療不敏感可能是導致此類患者預后較差的一個因素，建議TNBC且肥胖患者應適當控制體質量，糖尿病患者有效控制血糖，降糖的同時降低FASN的活性，以獲取更好的療效。研究[9]發(fā)現(xiàn)，針對FASN靶點的治療，聯(lián)合抑制EGFR和FASN活性不但具有較強的抗腫瘤作用，而且對化療藥物有耐藥性的TNBC也有效，因此同時封鎖FASN和EGFR靶點在TNBC是一個新的治療方向。

TNBC的預后受多種生物學因素影響，包括多種蛋白相互作用、基質環(huán)境、基因拷貝數(shù)等。本研究檢測c-Met及FANS在TNBC中的表達結果發(fā)現(xiàn)，c-Met及FASN在TNBC癌組織中的陽性率均高于癌旁組織, c-Met及FASN陽性表達患者的5年無瘤生存率均低于陰性表達患者，說明c-Met及FASN的陽性表達影響TNBC患者的預后。c-Met和FASN都與EGFR有協(xié)同抗腫瘤作用，針對TNBC的這兩個靶點治療，都需要聯(lián)合抑制EGFR。本研究首次探討2項指標與TNBC治療及預后相關指標的關聯(lián)性，為闡明TNBC細胞增殖、進展、轉移的機制及靶向藥物的研制提供一定依據(jù)，同時也可作為判斷TNBC患者預后的檢測指標。