不同分子亞型乳腺癌中骨形態(tài)發(fā)生蛋白9及胰島素樣生長因子-1的表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性

桂照華, 吳 景, 李曉潔, 閆 紅

(1. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床病理中心, 安徽 合肥, 230001;2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū)/安徽省腫瘤醫(yī)院 病理科, 安徽 合肥, 230001)

乳腺癌是發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性的生命健康[1-2]。St. Gallen乳腺癌共識(shí)[3]根據(jù)乳腺癌分子的表達(dá)狀態(tài)對(duì)乳腺癌進(jìn)行了分組，每個(gè)分子亞型對(duì)內(nèi)科治療、手術(shù)治療、化療的敏感性以及預(yù)后均存在一定的差異。胰島素樣生長因子-1( IGF-1)屬于胰島素樣生長因子家族一員，可增強(qiáng)有絲分裂，調(diào)節(jié)體內(nèi)激素的合成、分泌，并對(duì)細(xì)胞的趨化、免疫和遷移具有一定的影響。研究[4]表明, IGF-1在乳腺癌中也存在較高的表達(dá)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP-9)屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白的一種，可調(diào)控人體細(xì)胞的生長和分化。研究[5]證實(shí)，BMP-9在乳腺癌的細(xì)胞增殖分化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但其與乳腺癌患者臨床體征的關(guān)系仍未明確。本研究對(duì)98例乳腺癌患者的臨床資料進(jìn)行分析，探討B(tài)MP-9、IGF-1在不同分子亞型乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月—2020年3月收治的98例乳腺癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 患者符合《乳腺癌臨床診斷治療實(shí)用手冊(cè)》[6]中乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn); ② 患者年齡>18歲; ③ 患者精神正常; ④ 患者無大面積癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 患者存在腦梗死或者心肌梗死等重大疾病; ② 患者存在肺、肝、腎等重要器官障礙; ③ 患者存在免疫功能缺陷性疾病; ④ 患者資料不全; ⑤患者中途死亡或退出。

根據(jù)不同乳腺癌分子亞型將98例乳腺癌患者進(jìn)行分組: ER和PR陽性、HER-2陰性、KI-67低表達(dá)為Luminal A型組(n=23); ER和PR陽性、HER-2陰性、KI-67高表達(dá)或者ER和PR陽性、HER-2陰性、KI-67任何水平為Luminal B型組(n=26); ER和PR陰性、HER-2陽性為HER-2過表達(dá)型組(n=24); ER陰性、PR陰性、HER-2陰性為Basal-like型組(n=25)[7]。Luminal A型組患者年齡43～77歲，平均(56.96±10.00)歲; Luminal B型組患者年齡29～79歲，平均(47.81±13.37)歲; HER-2過表達(dá)型組患者年齡30～80歲，平均(51.00±11.28)歲; Basal-like型組2患者年齡33～73歲，平均(48.92±10.30)歲。4組患者年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究所有患者及家屬知情且簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

BMP-9檢測方式: 采用石蠟包埋組織切片提取乳腺癌組織總RNA, 石蠟組織切片總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure FFPE Kit)購自北京天根公司。將乳腺癌組織取樣后，迅速浸入4%～10%的甲醛中固定14～24 h, 徹底脫水后用石蠟包埋并切取5～10 μm厚度的石蠟切片8張，采用二甲苯脫蠟，并通過乙醇漂洗，接著通過蛋白酶K(Proteinase K)和DNA裂解液分別消化組蛋白和裂解DNA, 防止DNA和蛋白污染。最后通過吸附柱收集RNA后，利用NanoDrop微量分光光度計(jì)定量分析RNA的濃度和純度。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求合成cDNA, 采用北京天根公司的Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒，嚴(yán)格按照說明書，以20 μL體系進(jìn)行加樣, 2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL, 上游引物為1 μL, 下游引物為1 μL, cDNA為1 μL, 雙蒸水(ddH2O) 8 μL。反應(yīng)條件為90 ℃持續(xù)預(yù)變性, 10 min; 按照95 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)連續(xù)循環(huán)反應(yīng)。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物, BMP9上游引物序列為5′-GTCTTACAGGAGCATCAGCACAG-3′, 下游引物序列為5′-GGAGTCACAACCCACAGATTG-3′; GAPDH上游引物序列為5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′, 下游引物序列為5′-GTAGAGGCAGGGATGATAGGCT-3′。所有標(biāo)本均置于100 mL/L的中性甲醛內(nèi)固定; 將石蠟包埋組織以2 μm厚度進(jìn)行切片; 常規(guī)脫蠟，并采用抗原進(jìn)行修復(fù)后封閉，采用SP法染色，使用北京中杉金橋公司的DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，采用蘇木素再次染色，脫水，透明，封片后采用顯微鏡觀察。BMP-9陽性標(biāo)準(zhǔn)為棕黃色顆粒，參考HODGSON J等[8]研究采用的方法。每位患者連續(xù)進(jìn)行3次檢測，并求平均值。

IGF-1檢測方式: 將乳腺癌組織取樣后，迅速浸入4%～10%的甲醛中固定14～24 h, 徹底脫水后用石蠟包埋并切取5～10 μm厚度的石蠟切片8張，采用二甲苯脫蠟及乙醇漂洗，接著通過蛋白酶K (Proteinase K)和DNA裂解液分別消化組蛋白和裂解DNA, 防止DNA和蛋白污染。最后通過吸附柱收集RNA后，利用NanoDrop微量分光光度計(jì)定量分析RNA的濃度和純度，采用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。IGF-1基因上游引物序列為TGGAGTTGGTAGATT GCTGTTG, 下游引物序列為TATGAAGGGAGGTGGTGGGTAT, 產(chǎn)物大小為233 bp; β-actin(內(nèi)參基因)上游引物序列為AGCGGGAAA TCGTGCGTGAC; 下游引物序列為ACATCTGCTGCAGGAAGG TGGAC, 產(chǎn)物大小為453 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂凝膠電泳，采用EB染色后，在紫外熒光數(shù)字成像儀下進(jìn)行拍攝，并以吸光度定量分析，以β-actin為內(nèi)參或?qū)φ? IGF-1擴(kuò)充產(chǎn)物條帶吸光度與β-actin條帶吸光度的比值作為IGF-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所有標(biāo)本均放于100 mL/L的中性甲醛內(nèi)固定; 將石蠟包埋組織以2 μm厚度進(jìn)行切片; 常規(guī)脫蠟，并采用抗原進(jìn)行修復(fù)后封閉，采用SP法染色，采用北京中杉金橋公司的DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，采用蘇木素再次染色，脫水，透明，封片后采用顯微鏡觀察。IGF-1陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜為棕黃色顆粒，采用Volm雙色法進(jìn)行評(píng)分[9]。顯微鏡視野下染色細(xì)胞<10%為(+), 10%～50%為(), >50%為()。每例患者連續(xù)進(jìn)行3次檢測，并求平均值。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)4組患者骨BMP-9、IGF-1表達(dá)水平進(jìn)行比較; 對(duì)患者腫瘤組織內(nèi)BMP-9、IGF-1表達(dá)水平與患者臨床體征的關(guān)系進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 4組患者BMP-9表達(dá)水平比較

BMP-9在98例乳腺癌中陰性表達(dá)為36例，陽性表達(dá)為62例; HER-2過表達(dá)組BMP-9 mRNA水平和BMP-9蛋白陽性率與Basal-like組比較，差異無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); HER-2過表達(dá)組和Basal-like組BMP-9 mRNA水平和BMP-9蛋白陽性率均低于Luminal型A組及Luminal B型組，且Luminal B型組低于Luminal A型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組患者BMP-9表達(dá)水平比較

2.2 4組患者IGF-1表達(dá)水平比較

IGF-1在98例乳腺癌中陰性表達(dá)為36例，陽性表達(dá)為62例; HER-2過表達(dá)型組IGF-1mRNA水平和IGF-1蛋白陽性率與Basal-like型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); HER-2過表達(dá)型組和Basal-like 型組IGF-1 mRNA水平和IGF-1蛋白陽性率均高于Luminal A型組及Luminal B型組，且Luminal B型組高于Luminal A型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組患者IGF-1表達(dá)水平比較

2.3 BMP-9表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系

乳腺癌患者BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表達(dá)與年齡無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 乳腺癌患者BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 BMP-9表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系

2.4 IGF-1表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

乳腺癌患者IGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表達(dá)與年齡無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 乳腺癌患者BIGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 IGF-1表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系

2.5 BMP-9、IGF-1表達(dá)與患者臨床特征相關(guān)性分析

BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表達(dá)與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和TNM分期呈負(fù)相關(guān); IGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表達(dá)與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和TNM分期呈正相關(guān)。見表5。

表5 BMP-9、IGF-1表達(dá)與患者臨床特征相關(guān)性分析

3 討 論

乳腺癌是指出現(xiàn)在乳腺上皮以及導(dǎo)管上皮的惡性腫瘤，其病因尚未明確，可能與家族史和乳腺癌相關(guān)基因、生殖激素、性激素有關(guān)。乳腺癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅女性生命健康。由于乳腺癌的早期癥狀并不明顯，僅出現(xiàn)乳房腫塊、乳房皮膚異常等癥狀，所以通常在確診時(shí)已為中晚期，癌細(xì)胞已出現(xiàn)遠(yuǎn)處擴(kuò)散，同側(cè)腋窩淋巴結(jié)腫大且出現(xiàn)全身病變，預(yù)后極差，故乳腺癌的早期診斷極其重要[10-12]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對(duì)乳腺癌研究的加深，已有關(guān)于診斷乳腺癌基因?qū)θ橄侔┥飳W(xué)行為和預(yù)后的相關(guān)研究[13-15]。為進(jìn)一步了解不同亞型乳腺癌組織中的生化變化，本研究對(duì)比了不同類型及預(yù)后患者的BMP-9及IGF-1表達(dá)水平。

BMP-9又被稱為生長分化因子2, 參與血管、骨的生成和再生，且能夠維持胚胎神經(jīng)元的類膽堿分化和調(diào)節(jié)葡萄糖、脂肪酸的代謝等[16]。IGF-1是一種多功能生長因子，能夠幫助細(xì)胞增殖分化和凋亡，參與多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲[17]。相關(guān)文獻(xiàn)將乳腺癌根據(jù)臨床分子不同分為了4種亞型，包括Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型、Basal-like型。本研究表明, HER-2過表達(dá)型組和Basal-like型組BMP-9 mRNA水平和BMP-9蛋白陽性率顯著低于Luminal A型組和Luminal B型組，且Luminal B型組顯著低于Luminal A型組; IGF-1mRNA水平和IGF-1蛋白陽性率顯著高于Luminal A型組和Luminal B型組，且Luminal B型組顯著高于Luminal A型組(P<0.05)。既往研究[18-19]認(rèn)為, HER-2過表達(dá)型和Basal-like型的預(yù)后最差，也容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，Luminal A型預(yù)后最佳，提示BMP-9和IGF-1在乳腺癌的發(fā)展和預(yù)后發(fā)揮重要作用。本研究認(rèn)為，乳腺癌患者BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，且與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和TNM分期呈負(fù)相關(guān)。BMP-9水平的降低也是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后較差的原因之一。研究認(rèn)為, IGF-1在體內(nèi)含量越高，出現(xiàn)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)也越高。薛晶等[20]研究認(rèn)為，乳腺癌組織內(nèi)的IGF-1高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，與本研究結(jié)果相符，即乳腺癌患者IGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期呈正相關(guān)。分析原因可能為IGF-1在乳腺癌發(fā)展的早期就已出現(xiàn)，同時(shí)由于乳腺癌生長、惡性程度以及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致體內(nèi)IGF-1異常表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)BMP-9與IGF-1的表達(dá)水平具有極強(qiáng)的相關(guān)性，且兩者均屬于Smad通路，提示Smad通路的調(diào)節(jié)異?？赡苁侨橄侔┌l(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素[21]。

綜上所述, BMP-9、IGF-1的表達(dá)與乳腺癌患者臨床分子亞型有關(guān), BMP-9在Basal-like型和HER-2過表達(dá)型中表達(dá)較低, IGF-1在Basal-like型和HER-2過表達(dá)型中表達(dá)水平較高。BMP-9的表達(dá)與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和TNM分期呈負(fù)相關(guān); IGF-1的表達(dá)與上述指標(biāo)呈正相關(guān)。在臨床工作中，應(yīng)將BMP-9、IGF-1納入檢測，以預(yù)測患者臨床預(yù)后，并對(duì)IGF-1高表達(dá)、BMP-9低表達(dá)的患者進(jìn)行積極干預(yù)，以改善臨床療效。