腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的影響

申 潔 王玉國 郭平毅 原向陽

（1長治學院生物科學與技術系，046011，山西長治；2山西農業(yè)大學農學院，030801，山西太谷）

據統(tǒng)計，全球每年因干旱導致的糧食減產占減產總量的50%以上，干旱成為影響糧食作物生長、產量及分布的最主要非生物脅迫之一[1-2]。谷子[Setariaitalica(L.) Beauv.]被譽為“五谷之首”，營養(yǎng)價值高，是我國北方旱作農業(yè)的主要糧食作物之一[3]。谷子具有基因組小、生長周期短及耐瘠耐旱性強等特點，是禾本科作物抗性機理研究的模式植物[4]。谷子雖然耐旱，但干旱仍然是制約其發(fā)展的重要因素之一。

近年來，應用外源物質緩解或減輕植物干旱脅迫已成為植物抗旱性研究的熱點。腐植酸（humic acid，HA）是一類成分復雜的天然有機物，能通過根、莖和葉進入植物體，可提高植物光合作用，促進生長發(fā)育[5]，改善形態(tài)生理特征，在緩解多種逆境對作物的脅迫中發(fā)揮重要作用[6-8]。因此，研究腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle，AsA-GSH）的影響對探索提高谷子抗旱的途徑具有重要意義。

腐植酸可通過控制植物體內活性氧類物質的含量來協助植物抵御逆境脅迫[9]。適宜濃度的黃腐酸鉀可提高玉米細胞保護酶含量，降低丙二醛含量和膜脂過氧化程度，增加膜的穩(wěn)定性，提高植物抗旱性[10]。李英浩等[11]研究表明，腐植酸可緩解干旱脅迫對燕麥光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）光反應系統(tǒng)產生的傷害。關于腐植酸緩解谷子干旱脅迫的研究表明，腐植酸主要通過保持植物體內水分含量及提高PSⅡ和光合系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）的實際光化學速率來促進光合作用，誘導滲透調節(jié)物質產生，提高抗氧化系統(tǒng)的作用，以提高谷子抗旱性，降低干旱對質膜的損傷，從而有效緩解干旱脅迫對谷子的傷害[12]。AsA-GSH是植物清除活性氧（ROS）的酶促系統(tǒng)，在植物抵抗逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[13]。目前，腐植酸在農業(yè)領域應用廣泛，但針對谷子方面的研究較少，腐植酸能否調控干旱脅迫下AsAGSH循環(huán)代謝，從而緩解干旱脅迫帶來的損傷，目前尚不明確。本試驗研究腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質及相關代謝酶活性的影響，探討干旱脅迫下腐植酸調控AsAGSH循環(huán)代謝的機理，旨在為緩解干旱脅迫對植物的傷害提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試谷子品種為普通優(yōu)質谷子晉谷21號（由山西省農業(yè)科學院經濟作物研究所提供）和雜交高產谷子張雜10號（由河北省張家口市農業(yè)科學院提供）。

腐植酸（C9H9NO6）分子量227.17，由山東西亞化學工業(yè)有限公司生產；泥炭土有機基質由丹麥品氏托普（集團）公司生產。

1.2 試驗設計

試驗于2018年6-8月在山西農業(yè)大學化學除草與化學調控實驗室及露天天臺進行。設置腐植酸處理濃度0、50、100、200和300mg/L（分別用T0、T1、T2、T3和T4表示），進行干旱脅迫，用不同濃度HA浸種12h，以蒸餾水浸種、不進行干旱脅迫為對照（CK）。浸種結束后，將種子置于濾紙上自然風干。

采用完全隨機設計，將浸種后的晉谷21號和張雜10號均勻播種于裝有基質的營養(yǎng)缽（13cm×15cm）中，每個處理重復3次，置于露天天臺上自然生長，并用遮陽網進行50%遮陰保護。種子萌發(fā)后，每盆定植6株，每天正常澆水以確保幼苗正常生長，待幼苗長至3～5葉期時停止?jié)菜–K正常澆水），進行干旱脅迫處理（自然干旱），脅迫10d后測定各指標。利用土壤水分測定儀TDR300（Spectrum，美國）測定干旱10d的基質含水量，為19.30%。

1.3 測定項目及方法

參照Nakano等[14]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；參照金夢陽等[15]的方法測定谷胱甘肽還原酶（GR）活性；參照Hoque等[16]的方法測定單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性；參照Doulis等[17]的方法測定脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性；參照Jiang等[18]的方法測定還原型抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（DHA）含量；參照Nagalakshmi等[19]的方法測定還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量。

1.4 數據統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理及作圖，采用DPS 6.5軟件進行數據統(tǒng)計分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗（α=0.05），圖表中數據均以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)相關代謝酶活性的影響

由圖1可知，干旱脅迫顯著提高了晉谷21號幼苗葉片的APX、GR、MDHAR和DHAR活性，其中張雜10號的APX和DHAR活性分別較CK顯著提高9.45%和10.12%，而MDHAR活性與CK相比無顯著差異。隨著HA濃度的增加，2個品種的APX、GR、MDHAR和DHAR活性均呈先升高后降低的趨勢，T2處理的酶活性最強，張雜10號葉片T2處理的APX活性較T0增加了12.61%，差異顯著；HA處理顯著提高了2個品種的DHAR活性，其中晉谷21號和張雜10號T2處理分別較T0提高了15.20%和16.19%。這表明適宜濃度的HA處理可提高谷子幼苗抗氧化酶活性，可有效緩解了干旱脅迫對谷子的傷害。

圖1 腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片APX、GR、MDHAR和DHAR活性的影響Fig.1 Effects of HA on APX, GR, MDHAR and DHAR activities in foxtail millet seedling leaves

2.2 腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片抗壞血酸含量的影響

由表1可知，干旱脅迫顯著提高了晉谷21號和張雜10號谷子幼苗葉片的還原型抗壞血酸（AsA）和總抗壞血酸（T-AsA）含量，其中AsA含量分別較CK增加了1.12和1.03倍，T-AsA含量分別增加了24.74%和44.65%。隨著HA濃度的提高，2個品種的AsA和T-AsA含量基本呈先升高后降低的趨勢，晉谷21號的AsA含量在T3處理時最高，較T0顯著增加了14.84%，T-AsA含量在T2處理時最高，較T0顯著增加了16.31%；張雜10號的AsA和T-AsA含量均在T2處理時最高，分別較T0顯著增加了33.00%和17.27%。干旱脅迫下，HA對晉谷21號和張雜10號幼苗葉片DHA含量的影響相對較小，分別在T2和T3處理時DHA含量最高。

干旱脅迫下，谷子幼苗葉片AsA/DHA值顯著增加，2個品種分別較CK增加了1.65和0.91倍。適宜濃度的腐植酸可提高AsA/DHA值，晉谷21號在T3處理時較T0顯著增加了29.49%，張雜10號在T2處理時較T0增加了36.28%，且差異均顯著（表 1）。

表1 腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗抗壞血酸含量的影響Table 1 Effects of HA on ascorbic acid contents in the seedlings of foxtail millet under drought stress nmol/μg FW

2.3 腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗葉片谷胱甘肽含量的影響

由表2可知，干旱脅迫下，晉谷21號和張雜10號谷子幼苗葉片GSH、GSSH和總谷胱甘肽（T-GSH）含量較CK均顯著增加。隨著HA濃度的增加，GSH和T-GSH含量出現上升的趨勢，晉谷21號在T2處理下含量最高，GSH和T-GSH分別較T0增加1.35%和1.14%，且差異顯著；張雜10號的GSH和T-GSH含量分別在T3和T2處理下最高，分別較T0顯著增加1.38%和1.04%，隨后開始下降，呈現先上升后下降的趨勢，而HA處理下谷子幼苗葉片GSSG含量較T0無顯著差異（除了張雜10號T3處理）。

表2 腐植酸對干旱脅迫下谷子幼苗谷胱甘肽含量的影響Table 2 Effects of HA on glutathione contents in the seedlings of foxtail millet under drought stress nmol/mg FW

干旱脅迫下2個品種的GSH/GSSG值較CK顯著降低，隨著HA濃度的增加，GSH/GSSG值基本呈先上升后下降的趨勢，2個品種的GSH/GSSG值均在T3處理時最大，分別較T0增加2.27%和7.14%，其中張雜10號差異達顯著水平（表2）。

3 討論

干旱使植物體內積累大量的O1、O2·、H2O2和·OH等活性氧（ROS）物質，造成膜脂過氧化，而植物為適應環(huán)境的改變，在漫長的進化過程中形成了抵抗ROS氧化毒害的抗氧化系統(tǒng)，精準調節(jié)植物體內的ROS代謝，從而維持或重建氧化還原平衡[20-21]。

AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)作為植物體內抗氧化系統(tǒng)的重要機制，是清除ROS的重要途徑。APX、GR、MDHAR和DHAR是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的關鍵酶，對循環(huán)系統(tǒng)中抗氧化物質AsA和GSH的再生及循環(huán)的有效運轉具有重要作用[22]。研究表明，HA可促進干旱脅迫下玉米[10]和甘蔗[23]活性氧的早期積累，并有效激活保護酶超氧化物歧化酶、過氧化物酶、APX和GR的活性。本研究中，干旱脅迫提高了晉谷21號和張雜10號的APX、GR、MDHAR和DHAR活性，這與董守坤等[24]的研究結果一致，雜交谷清除活性氧能力顯著高于常規(guī)谷，說明雜交谷具有較強的抗旱性，充分體現了雜種優(yōu)勢。HA提高了谷子APX、GR、MDHAR和DHAR活性，尤其對APX和DHAR活性作用更明顯，表明適宜濃度的HA處理可提高谷子幼苗AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)相關酶活性，從而促進干旱脅迫下谷子幼苗AsA-GSH循環(huán)的有效運轉，緩解干旱脅迫對谷子的傷害。

AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中主要的抗氧化物質，可抵御植物細胞活性氧造成的氧化脅迫[25]，維持體內抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[26]。AsA和GSH含量及其氧化還原狀態(tài)的改變是植物應對脅迫的一種生理性調節(jié)[27]，AsA、GSH含量及AsA/DHA、GSH/GSSH值的提高可維持細胞內抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而減緩脅迫對植物造成的傷害[28]。本研究表明，干旱脅迫可顯著提高谷子幼苗葉片中AsA、T-AsA、GSH、T-GSH含量及AsA/DHA值，降低GSH/GSSH值，這與鄭清嶺等[29]的研究結果一致。通過添加外源物質可提高抗氧化物質含量，從而緩解膜脂過氧化，本研究表明，腐植酸顯著提高了谷子葉片AsA、T-AsA、GSH、T-GSH含量以及AsA/DHA值，減緩了GSH/GSSH值的降低，使GSH/GSSH值升高，這與外源物質減輕秋茄[30]和茶樹[31]逆境脅迫傷害的研究結果一致。但也有研究表明外源物質可抑制逆境脅迫下AsA和GSH含量的升高[32]，這可能與逆境脅迫類型、脅迫強度（時間長短）和試驗材料等有關。本課題組前期研究表明，HA緩解和清除了干旱脅迫導致的ROS積累[12]，這可能由于HA提高了AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)相關酶活性、抗氧化物質含量以及提高了AsA/DHA和GSH/GSSH值，從而使AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)有效運轉，這與劉建新等[22]研究外源物質緩解燕麥逆境脅迫的結果一致。

4 結論

HA可提高干旱脅迫下APX、GR、MDHAR和DHAR活性，促進抗氧化物質AsA和GSH再生，使AsA/DHA和GSH/GSSH值增加，從而有效清除干旱脅迫引起的ROS積累，降低干旱脅迫對植物細胞膜的氧化損傷，有效緩解干旱脅迫對谷子幼苗生長的傷害。