大柴胡湯治療高血壓病潛在機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究*

陳凱明，李焱，薛一濤

1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

高血壓病作為一種慢性疾病，以動脈血壓增高為主要特征，持續(xù)高動力性循環(huán)狀態(tài)將出現(xiàn)一系列心、腦、腎等靶器官的損傷。目前我國成人高血壓病發(fā)病率為27.9%，與此同時正常高值血壓人群出現(xiàn)逐年增長趨勢[1]?！?020國際高血壓學會全球高血壓實踐指南》[2]結(jié)合全球的流行病學特征，立足不同國家和地區(qū)經(jīng)濟、醫(yī)療資源水平，針對性提出了“基本”及“理想”兩個血壓管理標準，重點強調(diào)了“降血壓是硬道理”的觀點。循證醫(yī)學和臨床研究進一步表明，西藥仍是當下調(diào)控血壓，減少靶器官損害的主體。相較其不良反應(yīng)，中醫(yī)藥在防治高血壓病的進程中發(fā)揮了獨特的優(yōu)勢[3]。尤其是經(jīng)方以其獨特的辨證體系，針對高血壓病的致病特點，提出了火邪上擾、氣機逆亂、痰飲內(nèi)阻3個高血壓病的病機特點[4]。臨床上大柴胡湯、半夏白術(shù)天麻湯、真武湯等系列經(jīng)典名方在“方證相應(yīng)”的指導(dǎo)下，對于高血壓病的治療發(fā)揮了良好的功效[5]。

大柴胡湯源于《傷寒論》，為主治少陽、陽明合病的代表方，主治胸脅苦滿，嘔不止，郁郁微煩，心下痞硬，或心下滿痛，大便不解[6]。以少陽樞機不利，郁熱內(nèi)結(jié)為主要病機?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》載：“逆春氣則少陽不升，肝氣內(nèi)變。”肝膽同司少陽的生發(fā)系統(tǒng)，若肝膽之氣失于升發(fā)，則肝氣內(nèi)郁，郁而為病，出現(xiàn)化火、生風、動血等證候?！坝惺亲C，用是方”，對于臨床上表現(xiàn)為眩暈、頭痛、煩躁易怒、胸脅不適、腹?jié)M等肝郁化火的高血壓病患者，用大柴胡湯疏肝解郁，通腹瀉熱往往取得良效。然而，目前大柴胡湯治療高血壓病僅限于文獻研究和臨床報道，缺少分子、基因?qū)用娴纳钊胙芯?。本研究將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，系統(tǒng)、全面地揭示大柴胡湯的作用機制，探索更多的降血壓通路，更好發(fā)揮中醫(yī)藥對高血壓病的防治作用[7]。

1 資料與方法

1.1 大柴胡湯活性成分篩選和潛在靶點檢索借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP)[8]篩選出柴胡、黃芩、半夏、枳實、芍藥、大黃、生姜、大棗所含化學成分。以同時符合口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.18為主要藥代動力學參數(shù)，篩選出8味藥物的主要活性成分[9-11]。將收集到的有效成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫檢索SMILE結(jié)構(gòu)，根據(jù)“配體之間相似性分布”原理采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索成分對應(yīng)靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)蛋白-靶點之間標準轉(zhuǎn)化。

1.2 大柴胡湯“藥物-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)一體化構(gòu)建為了構(gòu)建“藥物-化合物-靶點”一體化網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape3.6.1生物可視化軟件，充分展示藥物、化合物、靶點三者之間交互作用關(guān)系[12]。

1.3 高血壓病靶點預(yù)測以“Hypertension”為關(guān)鍵詞分別在OMIM、GAD、DisGeNET、PharmGKB、TTD、DrugBank 6個不同的數(shù)據(jù)庫中檢索高血壓病相關(guān)靶點，整合檢索結(jié)果，刪除重復(fù)靶點，構(gòu)建高血壓病靶點數(shù)據(jù)庫[13]。

1.4 直接作用靶點獲得及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將活性成分靶點與上述構(gòu)建的高血壓病靶點通過在線bioinformatics工具繪制藥物-疾病韋恩圖，并分析得到大柴胡湯治療高血壓病的映射靶點。將成分-疾病映射靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進行PPI構(gòu)建，將置信度0.7(high confidence)作為設(shè)定閾值，分析得到蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 拓撲分析和關(guān)建靶點篩選在生物學進程中，關(guān)鍵基因往往調(diào)控并影響其他基因功能的發(fā)揮[14]。將PPI數(shù)據(jù)以tsv格式導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，運用CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，獲得網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)；根據(jù)自由度(Degree)、介數(shù)(Betweenness Centrality)、接近中心性(Closeness Centrality)3個主要參數(shù)進行拓撲篩選，得到關(guān)鍵靶點[15]。

1.6 基因GO富集分析和KEGG信號通路分析利用Cytoscape3.6.1中的ClueGO插件，以(P<0.01)為閾值，對直接作用靶點進行分子功能(Molecular Function)、細胞組成(Cellular Component)富集分析；生物過程(Biological Process)運用 Funrich version3軟件[16]，進行通路注釋。通路富集分析采用經(jīng)典的Davidv在線分析工具對直接作用靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.01作為條件進行篩選，根據(jù)每條通路富集基因的數(shù)量，篩選出具有顯著差異的作用通路。

2 結(jié)果

2.1 大柴胡湯主要活性成分和預(yù)測靶點TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到8味中藥相關(guān)活性成分760個，進行ADME篩選，刪除重復(fù)成分，整合得到97個主要活性成分。參照相關(guān)的藥理學報道，列舉每味藥物代表性化合物的基本信息，見表1。例如MOL0358(β-谷甾醇)是生姜、大棗、白芍、半夏 大黃和黃芩共有的化合物；MOL0098(槲皮素)是大棗、柴胡共有的化合物；而MOL0422(山柰酚)是柴胡和白芍共有的潛在化合物。

表1 大柴胡湯中20個代表性化合物信息表

2.2 大柴胡湯“中藥-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建通過Cytoscape 3.6.1可視化軟件充分展示了“藥物-化合物-靶點”三者之間的網(wǎng)絡(luò)圖，大柴胡湯97個主要活性成分，與170個成分對應(yīng)的靶點存在 2 640 條互作關(guān)系，“中藥-化合物 -靶點”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

圖1 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 高血壓病主要靶點根據(jù)人類遺傳、疾病基因、藥物基因組學基因的不同特性，在6個不同的數(shù)據(jù)庫中檢索到“Hypertension”相關(guān)基因共1 757個，進行整合分析，刪除共有靶點，得到1 169個高血壓病靶點。

2.4 直接作用靶點篩選170個活性成分靶點與 1 169 個高血壓病相關(guān)靶點相互映射，最終得到84個成分-疾病直接作用靶點，見圖2。

圖2 活性成分-疾病直接作用靶點圖

2.5 大柴胡湯PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點拓撲篩選通過String數(shù)據(jù)庫，建立84個直接作用靶點蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。將String中下載的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1，采用CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，得到一個由79個節(jié)點和218條邊組成的網(wǎng)絡(luò)(圖3A)。第一次篩選以Degree(DC)、介數(shù)(BC)和接近中心性(CC)大于中位數(shù)進行篩選，得到22個節(jié)點和76條邊的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3B)；二次篩選以Degree大于中位數(shù)的2倍進一步篩選，最終構(gòu)建11個節(jié)點和37條邊的大柴胡湯作用于高血壓的核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖3C)。用節(jié)點的大小表示Degree的大小，11個關(guān)鍵靶點依次為：IL-6、PTGS2、EGF、VEGFA、JUN、IL-1β、TNF、NOS3、F2、HMOX1、HTR2C詳見表2。

表2 大柴胡湯治療高血壓關(guān)鍵靶點基本信息表

注：A直接作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；B根據(jù)度(DC)、介數(shù)(DC)和接近中心性(CC)第一次篩選后網(wǎng)絡(luò)圖；C在第一次刪選基礎(chǔ)上根據(jù)度(DC)進一步篩選網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 大柴胡湯直接作用靶點GO功能富集分析通過對直接作用靶點GO富集分析發(fā)現(xiàn)，分子層面主要涉及蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)活性、酶結(jié)合、受體結(jié)合等方面；細胞組成層面主要涉及細胞質(zhì)膜、膜的組成、細胞外間隙、細胞溶質(zhì)等，見圖4。運用Funrich version3分析84個直接作用靶點的生物過程，主要涉及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞訊息傳遞、能量通道、新陳代謝等，見圖5。

注：A分子功能；B細胞組成

圖5 大柴胡湯治療高血壓病的生物過程示意圖

2.7 大柴胡湯KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，共獲得55條通路，根據(jù)P<0.01篩選得到25條相關(guān)通路，根據(jù)每條通路富集基因的數(shù)量，對前10條通路進行可視化處理，見圖6。通過查閱文獻大柴胡湯可能通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、血管表皮生長因子信號通路(vascular endothelial growth factor signaling pathway)等多途徑治療高血壓病。

注：Y軸代表pathway名稱，X軸代表Ratio，氣泡顏色代表富集的顯著性，即P值的大小，氣泡面積基因集中于這個pathway的基因數(shù)量，即Count值

3 討論

中藥藥理學技術(shù)的快速發(fā)展，一定程度上促進了中藥及其復(fù)方制劑有效成分對降血壓機制的研究。目前中醫(yī)防治高血壓病的作用機制主要從阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進、改善胰島素抵抗、抗炎利尿等多個方面發(fā)揮對血壓的調(diào)控作用[17]。與此同時，中藥復(fù)方的復(fù)雜性、藥物基礎(chǔ)不明、基礎(chǔ)與臨床研究脫節(jié)等一系列問題成為深入研究的瓶頸。本研究充分發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)藥理學系統(tǒng)性、整體性的優(yōu)勢，以經(jīng)方大柴胡湯治療高血壓病為切入點，為拓寬中醫(yī)藥防治高血壓病的治療途徑做出有益探索。

分析藥代動力學篩選結(jié)果，得到大柴胡湯97種性質(zhì)較好具有代表性的化合物。其中β-谷甾醇、兒茶素、黃芩素、槲皮素、蘆薈大黃素等多種活性成分均具有良好的抗高血壓相關(guān)作用。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫等功效，可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)在血管內(nèi)的堆積，增強血管彈性，使血壓下降[18]。白芍、大棗中所含的兒茶素被譽為“血管穩(wěn)定劑”，通過促進NO的釋放，改變內(nèi)皮細胞的血流動力以及抑制血小板聚集，促進血紅素氧化酶的表達以維持體內(nèi)血壓平衡，具有強效的降血壓活性[19]。本研究也證實了靶點凝血酶、血紅素加氧酶在整個復(fù)方中發(fā)揮重要的降血壓作用。黃芩素、槲皮素、蘆薈大黃素等均可通過抑制炎癥免疫反應(yīng)，作用于血管內(nèi)皮細胞，直接或間接參與抗高血壓病的作用[20-22]。大柴胡湯良好的活性成分為進一步探討其抗高血壓病的機制研究提供藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

結(jié)合KEGG富集所獲得的高血壓病相關(guān)通路與通路上所富集的關(guān)鍵靶點，進一步分析發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯可能通過參與免疫炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能、血管的舒縮、血液流變學等多個環(huán)節(jié)治療高血壓病。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥因子參與了高血壓病的發(fā)生發(fā)展，高血壓病被視為一種慢性低度炎癥性疾病[23]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-1β、TNF、PTGS2為主的關(guān)鍵靶點均富集在TNF信號通路上，高血壓病的進展與發(fā)生可能與炎癥免疫疾病的發(fā)生密切相關(guān)。臨床研究證實，相比健康人群，高血壓病患者血清中TNF-α和IL-6水平與疾病程度呈正相關(guān)[24]。以往研究表明，TNF-α直接通過細胞毒性作用，對血管的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。同時TNF-α還可以與血小板源生長因子誘導(dǎo)單核細胞和纖維細胞產(chǎn)生 IL-6[25]。兩者共同促進血管平滑肌細胞增殖，引起血管內(nèi)皮細胞壞死，導(dǎo)致血栓形成，控制脂溶酸活性，抑制脂蛋白脂酸活性與脂質(zhì)溶解，脂質(zhì)沉積于血管壁，加速動脈粥樣硬化[26]。近年來，保護血管內(nèi)皮功能和抑制血管重構(gòu)亦是高血壓病領(lǐng)域研究聚焦的熱點方向[27]。高血壓病患者隨著病程的增長往往伴有血管內(nèi)皮損傷，同時刺激產(chǎn)生和釋放包括內(nèi)皮素在內(nèi)的血管收縮因子以及各種生長因子。內(nèi)皮舒張因子及收縮因子的失衡，促進氧化應(yīng)激、激活炎癥反應(yīng)、活化血小板聚集，最終導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙[28]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子通過提高微血管的通透性，促進炎性細胞滲入，使內(nèi)皮細胞發(fā)生增殖、遷移、分化，同時抑制其凋亡[29]。本研究在VEGF signaling pathway信號通路中發(fā)現(xiàn)有大柴胡湯與高血壓病共同直接作用靶點PLA2G4A、PTGS2、VEGFA、NOS3、KDR。因此，推測大柴胡湯可能通過調(diào)節(jié)VEGF signaling pathway通路治療高血壓病。鈣信號通路(Calcium signaling pathway)廣泛參與人體各個生理病理活動。研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)鈣離子水平升高是高血壓病形成的重要機制，血管平滑肌細胞的收縮是通過鈣離子細胞形態(tài)實現(xiàn)的。當鈣離子通道開放時，平滑肌收縮，相反，選擇性阻斷鈣離子通道可以阻滯鈣離子向細胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，使細胞內(nèi)鈣離子濃度降低，平滑肌恢復(fù)松弛，達到舒張血管和降低血壓的目的[30-31]。其他一些信號通路諸如神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)，通過參與自主神經(jīng)和大腦皮層的活動對血壓產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，在網(wǎng)絡(luò)藥理學研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)預(yù)測的關(guān)鍵靶點和通路表明，大柴胡湯治療高血壓的可能機制：①參與炎癥反應(yīng)、血管舒張、改善血管內(nèi)皮功能等多靶點參與血壓的調(diào)控作用；②通過腫瘤壞死因子信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性受體通路等多通路發(fā)揮降血壓作用。為進一步深入探討大柴胡湯治療高血壓的作用機制提供參考依據(jù)。由于網(wǎng)絡(luò)模型并不能完全揭示藥物在生物體內(nèi)狀況，因此，分析出的作用靶點和潛在的通路機制還需進一步實驗證實[32]。