miR-212-3p抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲

閆茹誠，張 陳，張 澤，王 沖，劉甜甜，黃后寶

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 泌尿外科,安徽 蕪湖 241001)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。膀胱癌可分為兩類：非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle- invasive bladder cancer，NMIBC)、肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)，約有30%的NMIBC患者進展為MIBC，后者多有轉移，預后差[2]。目前治療膀胱癌的方法主要是手術結合化療和放療的多元化治療手段，但是膀胱癌的發(fā)病率和病死率仍然較高。因此，充分挖掘膀胱癌的分子機制是目前膀胱癌的研究熱點。

近年來，有報道稱多種microRNA (miRNA)參與了人類癌癥的發(fā)病過程，其中miRNA可以作為癌基因和腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[3]。miRNA是一類由大約19～24個核苷酸組成的非編碼小 RNA 分子，通過靶向下游mRNA影響其轉錄或翻譯從而調控基因的表達[4]。已有文獻報道m(xù)iR-212-3p參與各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展：miR-212-3p通過直接靶向MAP3K3抑制高級別漿液性卵巢癌進展[5]；miR-212-3p通過抑制SGK3從而調控膠質母細胞瘤細胞增殖[6]；miR-212-3p通過抑制結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)從而抑制人肝癌細胞的增殖和侵襲[7]。本研究將探討miRNA-212-3p在膀胱癌組織及細胞中的表達情況以及其對膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞系及細胞培養(yǎng) 人正常尿路上皮細胞SV-HUC-1及人膀胱癌細胞株T24和EJ均來自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。SV-HUC-1在F-12K培養(yǎng)基(Gibco,美國)中培養(yǎng)，膀胱癌細胞株在RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco,美國)中培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清(Gibco，美國)，所有細胞均在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 組織標本 收集弋磯山醫(yī)院泌尿外科30對新鮮膀胱癌組織及相鄰正常組織，所有組織均來源于膀胱癌根治術后標本，相鄰正常組織為距肉眼可見的癌腫5 cm以外的組織。立即用液氮冷凍至RNA提取。所有患者均簽署知情同意書，男18例，女12例，平均年齡(55.0±3.4)歲。所有組織標本均儲存于弋磯山醫(yī)院中心實驗室-80℃冰箱及液氮中。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 實時熒光定量PCR(qPCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen)從組織或培養(yǎng)細胞中提取總RNA。用qPCR檢測miR-212-3p的表達水平,所使用的 miRNA逆轉錄試劑盒及SYBR試劑盒均購于廣東銳博有限公司，內參引物使用U6。

1.4 細胞轉染 人miR-212-3p模擬物(miR-212-3p mimic)和陰性對照模擬物(miR-212-3p mimic NC)均購于廣東銳博有限公司。提前1天將T24和EJ細胞接種到6孔板中，根據制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(賽默飛，美國)進行瞬時轉染。

1.5 細胞增殖實驗 采用CCK8試劑盒(上海yeason生物有限公司，中國)檢測細胞增殖情況。將已經轉染的細胞以2 000個細胞/孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)3 d。每孔細胞加入10 μL的CCK8試劑，重新放回細胞培養(yǎng)箱避光孵育1.5 h后,酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度值(OD)。

1.6 細胞劃痕實驗 將轉染miR-212-3p mimic及miR-212-3p mimic NC的T24和EJ細胞消化并鋪板于6孔板，待細胞融合率達90%左右時，用1 000 μL的槍頭垂直劃豎線，然后用PBS輕輕沖洗2～3次，去除脫落的細胞，繼續(xù)加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分

別在0 h和24 h拍照。

1.7 Transwell小室侵襲實驗 將轉染的T24和EJ細胞消化，用無血清培養(yǎng)基重懸后鋪在包裹有基質膠的 Transwell小室(康寧公司，美國)，小室下層加入600 μL的含20%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，倒出培養(yǎng)基，使用多聚甲醛固定約20 min，去除多聚甲醛后再用0.1%結晶紫染色30 min，之后在200倍倒置顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 miR-212-3p在膀胱癌組織及細胞中表達水平低 研究發(fā)現miR-212-3p在膀胱癌組織中的表達水平較鄰近正常組織低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.20，P<0.01)，見圖1A。miR-212-3p在T24細胞與EJ細胞較正常尿路上皮細胞的表達水平低，差異有統(tǒng)計學意義(F=163.60，P<0.01)，見圖1B。提示miR-212-3p在膀胱癌中可能起到了抑癌作用。

A.qPCR比較膀胱癌組織與癌旁組織的miR-212-3p表達水平(**P<0.01);B.qPCR比較膀胱癌細胞與正常尿路上皮細胞的miR-212-3p表達水平(**P<0.01)。

2.2 miR-212-3p抑制膀胱癌細胞增殖 通過平板克隆實驗發(fā)現，與轉染miR-212-3p mimic NC相比，轉染miR-212-3p mimic組的T24細胞克隆數更少，差異有統(tǒng)計學意義(t=21.80，P<0.01),與轉染miR-212-3p mimic NC相比，轉染miR-212-3p mimic組的EJ細胞克隆數更少，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.01，P<0.01)，見圖2A、2B；通過CCK8法發(fā)現轉染miR-212-3p mimic組的T24細胞增殖能力弱于miR-212-3p mimic NC組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.19，P<0.01),轉染miR-212-3p mimic組的EJ細胞增殖能力弱于miR-212-3p mimic NC組，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.13，P<0.01)，見圖2C。

A.平板克隆實驗比較過表達miR-212-3p組與對照組的細胞增殖能力；B.采用t檢驗比較兩組細胞克隆數目(**P<0.01)；C.CCK8法比較過表達miR-212-3p組與對照組的生長曲線及細胞增殖能力(**P<0.01)。

2.3 miR-212-3p抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲 通過劃痕實驗及Transwell小室侵襲實驗發(fā)現，轉染miR-212-3p mimic組的T24細胞24 h后細胞遷移的距離相比轉染miR-212-3p mimic NC組較短，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.39，P<0.01)，轉染miR-212-3p mimic組的EJ細胞24 h后細胞遷移的距離相比轉染miR-212-3p mimic NC組較短，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.21，P<0.01)，見圖3A、3B；轉染miR-212-3p mimic組的T24細胞24 h后細胞侵襲的數目相比轉染miR-212-3p mimic NC組較少，差異有統(tǒng)計學意義(t=19.42，P<0.01)，轉染miR-212-3p mimic組的EJ細胞24 h后細胞侵襲的數目相比轉染miR-212-3p mimic NC組較少，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.08，P<0.01)，見圖3C、3D。以上結果表明miR-212-3p可以起到抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲的能力。

A.劃痕實驗比較過表達miR-212-3p組與對照組的細胞遷移能力；B.采用t檢驗比較兩組遷移距離(**P<0.01)；C.Transwell小室侵襲實驗比較過表達miR-212-3p組與對照組的細胞侵襲能力(200×)；D.采用t檢驗比較兩組侵襲細胞數目(**P<0.01)。

3 討論

膀胱癌目前仍是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，術后易復發(fā)，預后差，因此積極尋找新的腫瘤標志物及新的治療靶點是提高膀胱癌患者的生存率，預防局部復發(fā)和遠處轉移，改善膀胱癌患者預后的關鍵[8]。多項研究表明，miRNA可作為膀胱癌的診斷或治療靶點：Li等發(fā)現CircHIPK3可以通過抑制miR-558從而調控膀胱癌細胞中的乙酰肝素酶表達[9]；Li等報道了miR-21在膀胱癌患者的組織、血漿和尿外泌體中同時上調[10];Feng等發(fā)現miRNA-556-3p通過負調控DAB2IP表達促進人膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。miR-212-3p在多種腫瘤中作為抑癌因子被報道：CD80基因中miR-132-3p、miR-212-3p和miR-361-5p結合位點的功能性變異改變了中國漢族人群對胃癌的易感性[12]；LncRNA TUG1通過調控miR-212-3p/FOXA1軸影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[13]；在胰腺癌細胞IFN-γ通過抑制miR-212-3p從而上調 RFXAP水平[14]；巨孢霉素C通過激活miR-212-3p/Sox6通路抑制胃癌的增殖和侵襲。

越來越多的研究表明，miRNAs在調節(jié)其靶基因mRNA方面發(fā)揮著至關重要的作用[15]。一個miRNA可有多個靶基因與之結合[16]，miR-212-3p目前有多個已被報道的靶基因，如SGK3[17]、SOX5[18]、HMGB1[19]等，而SOX5作為癌基因在膀胱癌中被報道[20]，但均沒有解釋與miR-212-3p之間的關系，這些基因可作為miR-212-3p下游靶點進行進一步探究。因此，本文與之前多項研究的報道結果一致，miR-212-3p在膀胱癌中同樣下調并發(fā)揮抑癌基因的作用。首先本研究采用 qPCR 法檢測膀胱癌組織和鄰近癌組織中miR-212-3p的表達水平，結果發(fā)現，膀胱癌組織miR-212-3p表達水平相對較低，在細胞水平層面上也發(fā)現了同樣的結果，相較于SV-HUC-1，T24和EJ細胞中miR-212-3p表達水平相對較低，這表明miR-212-3p在膀胱癌中低表達，可能起到抑制腫瘤生長的作用。與此同時采用平板克隆實驗及CKK8實驗發(fā)現當過表達miR-212-3p后，T24和EJ細胞的增殖能力明顯減弱。為了進一步探明miR-212-3p對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響，本研究采用了劃痕實驗和Transwell實驗，結果發(fā)現，當過表達miR-212-3p后，T24和EJ細胞遷移的距離相較于對照組較短，穿過小室細胞的數目相較于對照組較少。這些結果表明miR-212-3p可以抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。

miR-212-3p已被證實在多種腫瘤中發(fā)揮作用，但miR-212-3p在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的潛在分子機制仍有待闡明。本研究發(fā)現miR-212-3p在膀胱癌組織和細胞系中表達水平低，證實了miR-212-3p對膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)揮調控作用。這些結果為miR-212-3p調控膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了新的研究路線，miR-212-3p有機會成為膀胱癌的潛在腫瘤標志物或新興的治療靶點。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-212-3p可以抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲，但沒有對其靶基因進行進一步的機制研究及進行動物模型驗證是本研究的局限性。本研究可能有助于深入了解miR-212-3p在人膀胱癌中發(fā)揮的作用，未來miR-212-3p在膀胱癌中是否能作為治療靶點值得進一步研究。