幼齡和成年牦牛肌纖維類型、MyHC基因表達(dá)及其肌肉抗氧化能力的比較研究

周 力，姚有莉，李蔣偉，馬博妍，高占紅，桂林生

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

肌纖維是組成骨骼肌的基本結(jié)構(gòu)單位，其數(shù)量在動(dòng)物出生時(shí)就基本穩(wěn)定，但肌纖維類型組成可以相互轉(zhuǎn)化[1]，即遵循Ⅰ?Ⅱa?Ⅱx/d?Ⅱb[2]。諸多研究表明，動(dòng)物肌纖維類型及組成與宰后肌肉品質(zhì)存在密切的關(guān)系[3-4]，主要受品種、營(yíng)養(yǎng)、性別、環(huán)境、運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激及生理階段等多種因素影響[5]。目前通過(guò)改變肌纖維類型來(lái)提高肌肉品質(zhì)已經(jīng)成為食品行業(yè)研究的熱點(diǎn)，然而主要集中于家禽，對(duì)反芻動(dòng)物（如牛、羊等）的研究較少，關(guān)于牦牛不同年齡階段的肌纖維形態(tài)特征更是鮮有報(bào)道。

牦牛（Bos grunniens）主要分布于青海、甘肅、云南、新疆和西藏等高海拔地區(qū)，約占世界牦?？偭康?5%[6]。且肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，開發(fā)潛力大，已成為純天然的綠色食品[7]。由于生物體不同發(fā)育時(shí)期對(duì)環(huán)境適應(yīng)及自身代謝途徑的存在一定的差異性，導(dǎo)致其肌肉組織中表達(dá)產(chǎn)物，如mRNA[8]、microRNA[9]以及l(fā)ncRNA[10]呈現(xiàn)出顯著的時(shí)序性，使得肌肉組織表型發(fā)生變化，在牦牛[11]、黃牛[12]以及綿羊[13]上尤為明顯。研究證實(shí)，剪切力是衡量牛肉品質(zhì)重要的指標(biāo)，能夠直接反映牛肉品質(zhì)的等級(jí)[14]。E.W.Miller等[15]根據(jù)剪切力的差異，將牦牛肉劃分為3個(gè)等級(jí)。即3歲齡以下的肉屬于嫩肉，3～7歲齡的肉屬于中等嫩肉，7歲齡以上的屬于老肉。當(dāng)前，隨著人們生活品質(zhì)的提高和膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，其中大理石花紋豐富、口感鮮嫩、風(fēng)味俱佳的優(yōu)質(zhì)高檔牛肉在肉品市場(chǎng)供不應(yīng)求。

基于此，本研究主要聚焦于3歲齡以下的優(yōu)質(zhì)牦牛肉，深入了解牦牛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中背最長(zhǎng)肌中肌纖維類型、直徑、橫切面積以及密度等的指標(biāo)變化，同時(shí)測(cè)定肌纖維類型緊密關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)水平和抗氧化指標(biāo)，以期為揭示牦牛肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從青海海北州海晏縣自然放牧條件下分別取3月齡和3歲齡健康的牦牛（♂）5頭。屠宰后立即取背最長(zhǎng)肌，將樣品裝入凍存管中置于液氮中速凍，帶回試驗(yàn)室后置于-80℃冰箱保存。該研究方案由動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：20180173）。

1.2 試劑和儀器

二甲苯（廣東光華科技股份有限公司）；乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司G8590）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）。德國(guó)LEICA2016切片機(jī)（德國(guó)leica公司）；RX50顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；羅氏LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；賽默飛Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 肌肉抗氧化指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)牦牛屠宰后，稱取背最長(zhǎng)肌肉樣加PBS（濃度為0.01 mol/L，pH值為7.2～7.4）制備10%組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，于-20℃保存待測(cè)?？寡趸笜?biāo)包括總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等。試劑盒購(gòu)于江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.3.2 肌肉組織學(xué)特性測(cè)定

將牦牛肌肉沿著肌纖維的垂直方向切成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉塊，依次經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定→流水沖洗30 min→不同濃度酒精脫水（由低到高）→二甲苯透明→石蠟包埋→切片機(jī)切片（厚度5～8 μm）→45℃恒溫箱烤片→二甲苯脫蠟→HE染色等程序制成石蠟切片。用ATP酶組織化學(xué)對(duì)牦牛背最長(zhǎng)肌進(jìn)行染色[16]。然后采用RX50顯微鏡觀察并分析肌纖維的各項(xiàng)指標(biāo)（包括各類型肌纖維直徑、橫切面積和密度、肌纖維面積比例），測(cè)試肌纖維總數(shù)不少于1 500根。

①肌纖維直徑：測(cè)量每根肌纖維橫切面上最長(zhǎng)兩點(diǎn)和最短兩點(diǎn)距離，計(jì)算其平均值。

②肌纖維橫切面積：圈出視野內(nèi)各型肌纖維的橫切面積，測(cè)多根求其平均值。

③肌纖維密度：圈出每個(gè)視野的面積，計(jì)算出每個(gè)視野內(nèi)肌纖維的根數(shù)，然后換算成每平方毫米的根數(shù)。

④肌纖維面積比例：用每種肌纖維總面積除以總肌纖維面積即為肌纖維面積比例，公式如下：

肌纖維面積比例=各型肌纖維總面積/總肌纖維面積100%

1.3.3 MyHC基因表達(dá)量測(cè)定

①RNA提取

依據(jù)動(dòng)物組織總RNA提取說(shuō)明書（北京天根生化科技有限公司）對(duì)牦牛背腰最長(zhǎng)肌中總RNA進(jìn)行提取。

②RNA濃度和質(zhì)量測(cè)定

將提取的總RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，凝膠成像儀拍照，超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)提取的總RNA的濃度和純度（A260nm/A280nm）。

③RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA

按照FastKing RT Kit cDNA第一鏈合成說(shuō)明書（北京天根生化科技有限公司）將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃冰箱保存。

④引物序列與合成

目的基因（MyHC、MyHC a、MyHCⅡb和MyHCⅡx）及內(nèi)參基因（GAPDH）引物引用參考文獻(xiàn)[17]所列。由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

⑤實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

按照的SuperReal PreMix Color（SYBR Green）說(shuō)明書（北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行，以cDNA為模板，使用羅氏LightCyler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀測(cè)定目的基因mRNA表達(dá)量。

⑥實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物檢測(cè)

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 2--ΔΔCt法分析實(shí)時(shí)定量 PCR目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量[18]，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常被用來(lái)確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)為 ΔCt。計(jì)算公式為：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。

采用SPSS 21.0軟件單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，并使用GraphPad Prism 7.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段牦牛肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性

2.1.1 牦牛肌纖維ATP染色結(jié)果

采用ATPase組織染色法對(duì)3月齡和3歲齡牦牛的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行染色，在20×10倍的顯微鏡下觀察，標(biāo)尺為50 μm，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)ATP酶染色后肌纖維主要分為3種類型，顏色最深（黑色）的均是Ⅰ型肌纖維，顏色最淺（白色）均是ⅡB型肌纖維，介于兩者顏色之間（棕褐色）均是ⅡA型肌纖維。

圖1 犢牛和成年牛的Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型肌纖維Figure 1 The type Ⅰ、ⅡA and ⅡB muscle fibers of calves and adults

2.1.2 不同發(fā)育階段牦牛肌纖維直徑、橫切面積和密度

由圖2可知，犢牛背最長(zhǎng)?、裥秃廷駻型肌纖維直徑顯著低于成年牛（P＜0.05），ⅡB型肌纖維也呈現(xiàn)低于成年牛趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）；同時(shí)犢牛背最長(zhǎng)?、裥汀ⅱ駻型ⅡB型肌纖維橫切面積均顯著低于成年牛（P＜0.05）；而肌纖維密度則相反（P＜0.05）。

2.1.3 不同發(fā)育階段牦牛肌纖維面積比例

由圖3可知，犢牛Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的面積比例大于犢牛（P＜0.05）；不論是成年牛還是犢牛，都以ⅡB型肌纖維面積比例最大，其中犢牛ⅡB肌纖維面積比例為80.61%；成年牛ⅡB肌纖維面積比例為93.95%。表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，牦牛肌肉中ⅡB型肌纖維有所增加，不同年齡會(huì)對(duì)肌纖維類型的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生一定影響。

2.2 不同發(fā)育階段牦牛MyHC基因表達(dá)規(guī)律

由圖4可知，犢牛MyHC 基因和MyHCⅡa基因的mRNA表達(dá)量均大成年牛，且在兩個(gè)年齡階段差異顯著（P＜0.05）；MyHCⅡb基因和MyHCⅡx基因mRNA表達(dá)量均為成年牛顯著大于犢牛（P＜0.05）；以上說(shuō)明牦牛MyHC基因表達(dá)量受不同年齡階段的影響較大。

圖4 牦牛MyHC基因表達(dá)量（n=5）Figure 4 Relative expression levels of MyHC genes in yak （n=5）

2.3 不同發(fā)育階段牦牛肌肉抗氧化能力

由表1可知，成年牦牛肌肉中總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和丙二醛等抗氧化指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由此可見，牦牛肌肉抗氧化能力受不同年齡階段的影響較小。

表1 牦牛肌肉抗氧化能力Table 1 Antioxidant capacity of Bos grunniens at different developmental stages

3 討論

3.1 不同發(fā)育階段牦牛組織形態(tài)學(xué)特性的比較

本試驗(yàn)通過(guò)ATP酶染色法對(duì)牦牛肌纖維分型，發(fā)現(xiàn)年齡增加使得背最長(zhǎng)肌肌纖維類型由氧化型纖維（MyHCⅠ和MyHCⅡa）向酵解型纖維（MyHCⅡb和MyHCⅡx）轉(zhuǎn)變。該結(jié)果與張麗等[19]提出的動(dòng)物肌纖維類型轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在生長(zhǎng)早期階段的觀點(diǎn)一致。采用qPCR技術(shù)對(duì)牦牛背最長(zhǎng)肌中與肌纖維類型緊密相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，肌纖維類型與MyHCs（MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx）密切相關(guān)，即Ⅰ型MyHC基因的表達(dá)水平與Ⅰ型肌纖維的數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系；ⅡA型和ⅡB型MyHC基因的表達(dá)水平也與ⅡA型和ⅡB型肌纖維數(shù)量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果與新疆褐牛、日本和牛等[20-21]黃牛品種上的研究結(jié)果一致。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，根據(jù)肌纖維直徑、單個(gè)肌纖維橫切面積和肌纖維密度可以判斷肉品質(zhì)的優(yōu)劣[22]。G.Renand等[23]試驗(yàn)表明，ⅡB型肌纖維比例越高剪切力越大，肉的嫩度越差。G.D.Kim等[24]也發(fā)現(xiàn)ⅡB型肌纖維直徑與眼肌面積呈正相關(guān)，但與嫩度呈負(fù)相關(guān)。趙雅娟等[25]進(jìn)一步證實(shí)，放牧條件可以降低蘇尼特羊背最長(zhǎng)肌酵解型纖維類型的比例，有利于其肉品質(zhì)。以上研究都表明氧化型纖維比例高有利于提高肉質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牦牛在成年前酵解型纖維的比例較低，由此可知不同年齡會(huì)影響肌纖維類型轉(zhuǎn)變，從而影響其肉質(zhì)。如何在牦牛成年前控制運(yùn)動(dòng)量、降低酵解型纖維類型的比例，改善放牧牛的肉品質(zhì)是未來(lái)的研究重點(diǎn)。

3.2 不同發(fā)育階段牦牛肌肉抗氧化能力的比較

動(dòng)物肌肉的氧化穩(wěn)定性主要取決于氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，其抗氧化能力越強(qiáng)，保鮮和延長(zhǎng)肉品貨架期的作用就越明顯[26]。T-AOC、SOD、GSH-PX、CAT和MDA等均是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，其中T-AOC代表了動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的總體水平[27]。SOD是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性間接反映機(jī)體清除自由基的能力[28]。GSH-PX能夠通過(guò)特異催化還原型谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜避免其受損[29]。而CAT可以促進(jìn)過(guò)氧化氫的分解，從而起到抗氧化作用[30]。MDA含量則是判定機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度[31]。因此，測(cè)定動(dòng)物肌肉中抗氧化指標(biāo)能夠反映抗氧化能力的大小，為牦牛的階段發(fā)育情況提供一個(gè)理論參考。Cho S.等[32]研究得出，2～12歲韓國(guó)肉牛背最長(zhǎng)肌中MDA的含量隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸增高，但差異不顯著。P.Gatellier等[33]試驗(yàn)也證實(shí)，年齡對(duì)動(dòng)物肌肉中抗氧化酶活力的影響僅僅發(fā)生在小鼠等小型哺乳動(dòng)物中，但在大型哺乳動(dòng)物中影響不明顯。本試驗(yàn)的兩個(gè)年齡組牦牛肉中T-AOC、SOD、GSHPX、CAT和MDA等指標(biāo)差異不顯著，與上述人員的結(jié)論基本一致。

綜上，3歲齡牦牛與3月齡相比，酵解型肌纖維類型增多，不利于改善肉品質(zhì)，同時(shí)抗氧化能力沒(méi)有明顯差異。