四川省主要糧食作物中鐮刀菌毒素污染規(guī)律分析

陳新元，董 飛，仲伶俐，武德亮，王淑芳，徐劍宏，馬桂珍*，史建榮，*

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（南京）/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210014；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，成都 610066）

近年來，隨著全球氣候條件變化及耕作制度改變，主要由禾谷鐮刀菌復(fù)合種（Fusarium graminearum species complex，F(xiàn)GSC）等侵染糧食作物引起的真菌病害在我國(guó)江淮及黃淮海地區(qū)頻繁重發(fā)，不僅會(huì)造成糧食產(chǎn)量損失、品質(zhì)降低，還會(huì)產(chǎn)生多種鐮刀菌毒素（Fusarium toxins），嚴(yán)重威脅人畜健康[1-2]。其中，以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-acetyldeoxynivalenol，3ADON）、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyldeoxynivalenol，15ADON）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）和鐮刀菌烯醇（fusarenone X，4ANIV）等為主的單端孢霉烯族化合物（trichothecenes）是我國(guó)糧食作物產(chǎn)品中污染最為普遍的鐮刀菌毒素[3-4]。單端孢霉烯族化合物是一類具有倍半萜類結(jié)構(gòu)的毒素，已發(fā)現(xiàn)的種類超過200種[5]。單端孢霉烯族毒素能夠抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成，對(duì)造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)都有很強(qiáng)的毒性，還可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、胃腸功能障礙、免疫功能和繁殖功能障礙等癥狀，具有致畸、致癌和致突變作用[6-7]。

Sun X.D.等[8]綜述了我國(guó)玉米中真菌毒素污染現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)河南、四川、江蘇和安徽等地玉米檢出的鐮刀菌毒素主要以DON為主。2019年Qiu J.B.等[9]分析了我國(guó)小麥鐮刀菌毒素污染現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)江蘇、安徽等地主要以DON和3ADON污染為主，河南、山東和河北等地以DON和15ADON污染為主，而四川和重慶等地以NIV和DON污染為主。Sun X.D.等[10]分析了我國(guó)水稻中真菌毒素污染現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)水稻樣品中真菌毒素種類主要以黃曲霉毒素為主，以trichothecenes為主的鐮刀菌毒素污染僅在廣西地區(qū)有所報(bào)道。為保護(hù)國(guó)民健康、食品安全及產(chǎn)業(yè)發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已先后對(duì)谷物中的DON限量值進(jìn)行了規(guī)定，GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》[11]規(guī)定谷物及其制品，具體涉及玉米、玉米面（渣、片）、小麥、大麥、麥片及小麥粉，其DON限量值為1 000 μg/kg。歐盟規(guī)定谷物、面粉及面包中DON限量分別為1 250、750 和 500 μg/kg[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種植制度對(duì)糧食作物中鐮刀菌毒素，尤其是trichothecenes影響顯著[13-14]。S.Vogelgsang等[15]報(bào)道在小麥-玉米輪作模式下，小麥中DON毒素含量較前茬玉米顯著增加；J.N.Selvaraj等[16]調(diào)查了水稻-小麥、玉米-小麥、棉花-小麥及大豆-小麥等輪作方式對(duì)江淮地區(qū)小麥中鐮刀菌毒素污染影響，發(fā)現(xiàn)水稻-小麥輪作方式下小麥中DON毒素污染水平最高，達(dá)到 4 899.3 μg/kg；Qiu J.B.等[17]比較江淮地區(qū)水稻-小麥及玉米-小麥輪作方式對(duì)小麥中鐮刀菌毒素污染影響，同樣發(fā)現(xiàn)水稻-小麥輪作方式下小麥中DON毒素污染水平顯著高于玉米-小麥輪作的小麥。

四川省是我國(guó)糧食主產(chǎn)省之一，主要糧食作物種類包括玉米、小麥和水稻等，主要種植制度包括水稻-小麥輪作、玉米-小麥套作及水稻-再生稻等種植制度[18]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于四川省糧食作物中鐮刀菌毒素污染報(bào)道相對(duì)較少[3-5]，種植制度對(duì)該地區(qū)糧食作物中鐮刀菌毒素污染影響尚不明確。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對(duì)2019年四川省玉米、小麥及水稻樣品中DON、3ADON、15ADON、NIV和4ANIV進(jìn)行測(cè)定，分析種植制度對(duì)糧食作物產(chǎn)品鐮刀菌毒素污染程度的影響，為四川糧食作物中鐮刀菌毒素污染監(jiān)管提供科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

試驗(yàn)所用儀器主要有Qtrap 6500 HPLC-MS/MS儀（美國(guó)AB SCIEX）、ME204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、MS3 digital渦旋儀（德國(guó)IKA公司）、5810R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、振蕩器DMT-2500（江蘇天翎儀器有限公司）、N-WVAPTM 112氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）、QuEChERS萃取包（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、0.22 μm水相濾膜（天津津騰公司）、Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）。

DON、3ADON、15ADON、NIV和4ANIV標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，ROMER國(guó)際貿(mào)易（北京）有限公司；甲醇（HPLC）、甲酸（HPLC），乙腈（HPLC），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)。

1.2 樣品采集

根據(jù)四川省糧食作物種植情況，采用入戶取樣收集的方法，對(duì)2019年四川省綿陽、南充、德陽、資陽、內(nèi)江、瀘州和自貢等7個(gè)糧食主產(chǎn)區(qū)農(nóng)戶家中當(dāng)年所收獲的玉米、小麥及水稻樣品進(jìn)行隨機(jī)取樣。每份樣品按真菌毒素含量控制取樣法[19]采集2.0 kg，樣品采集后及時(shí)密封，4℃保存。收集樣品共311份，其中玉米86份、小麥103份、水稻122份，具體樣品采集地區(qū)、種植方式及樣品數(shù)量見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品制備

分別將玉米、小麥和水稻樣品四分法縮減至少500 g，將樣品粉碎至完全通過20目篩，混合均勻后裝入樣品密封袋中于-20℃避光保存，防止樣品受污染和變質(zhì)，以備用。

1.3.2 樣品提取與凈化

采用Dong F.等[20]報(bào)道的 QuEChERS方法對(duì)糧食作物樣品進(jìn)行提取與凈化。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL的乙腈∶甲酸∶水溶液（體積比 80∶0.1∶19.9），振蕩器2 500 r/min振蕩30 min后加入QuEChERS萃取包，振蕩器2 500 r/min振蕩2 min使其全部分散。10 000 r/min離心5 min，取2 mL上清轉(zhuǎn)移到玻璃試管中，于50℃水浴中氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑锛尤? mL乙腈∶水溶液（體積比1∶1）復(fù)溶，于渦旋混合器上振蕩1 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜于樣品瓶中，供HPLCMS/MS檢測(cè)。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；進(jìn)樣量 5 μL；柱溫 35 ℃；流動(dòng)相：A為水（含0.1%甲酸），B為甲醇，流速0.5 mL/min。梯度洗脫條件：0～2 min，流動(dòng)相中水相（A）比例由90%下降至 50%；2～4 min，流動(dòng)相中水相（A）比例由50%提升至 60%；4～5 min，流動(dòng)相中水相（A）比例由60%上升至95%；5.0～8.0 min，保持流動(dòng)相中水相（A）比例為 95%；8～10 min，流動(dòng)相中水相（A）比例由95%下降至10%；10～15 min，保持流動(dòng)相中水相（A）比例為10%。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式：正負(fù)離子模式同時(shí)掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源溫度600℃；駐留時(shí)間100ms；霧化氣（氮?dú)猓?5psi；輔助氣（氮?dú)猓?0psi；噴霧電壓5 500 V；碰撞室射出電壓6 V。鐮刀菌毒素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 鐮刀菌毒素質(zhì)譜參數(shù)Table 2 HPLC-MS/MS parameters for Fusarium toxins

1.4.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取5.0 g（精確到0.01 g）未檢出鐮刀菌毒素的不同空白糧食樣品于50 mL離心管中，按1.3操作進(jìn)行樣品制備、提取及凈化，將5種鐮刀菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液稀釋配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，DON、3ADON、15ADON 和 4ANIV 標(biāo) 定 為 10、50、200、500 和 1 000 μg/L；NIV 標(biāo)定為 20、100、500、1 000和2 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.4 方法的回收率

采用本研究建立的方法對(duì)添加5種鐮刀菌毒素的糧食樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別在3種糧食作物中添加DON、3ADON、15ADON、NIV 和 4ANIV 使 其 達(dá) 到20、200和 1 000 μg/kg，每個(gè)添加量重復(fù) 6次，測(cè)定方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error，SE）表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，單因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U法檢驗(yàn)處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限、定量限及回收率

以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸方程，根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值得到方法的檢出限，根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值得到線性范圍的下限。DON、3ADON、15ADON和4ANIV的檢出限為 3 μg/kg，定量限為 10 μg/kg；NIV 檢出限為5 μg/kg，定量限為 20 μg/kg。DON、3ADON、15ADON、NIV和4ANIV在玉米、小麥和水稻中回收率為80.9%～97.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.8%（表3）；符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范基本信息食品理化檢測(cè)》中的相關(guān)要求[21]。

表3 不同糧食作物中鐮刀菌毒素檢測(cè)回收率(n=6)Table 3 Recovery of Fusarium toxins in cereals(n=6)

2.2 四川省糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染水平

通過對(duì)2019年四川省糧食作物中5種鐮刀菌毒素污染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（表4），該地區(qū)糧食樣品中鐮刀菌毒素污染種類以NIV為主，檢出率達(dá)到70.7%；NIV平均含量為（497±82.1）μg/kg，顯著高于3ADON、15ADON 和 4ANIV（P＜0.05），但與 DON 沒有顯著差異（P＞0.05）。

表4 四川省糧食作物樣品鐮刀菌毒素污染總體情況Table 4 Contamination of Fusarium toxins in cereals

2.3 不同糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染水平

比較2019年四川省不同糧食作物中鐮刀菌毒素污染種類發(fā)現(xiàn)（表5），玉米中3ADON未檢出，DON和NIV檢出率分別為44.2%和37.2%；小麥樣品中5種鐮刀菌毒素均有檢出，其中NIV檢出率最高達(dá)96.1%，DON次之（78.6%）；水稻中3ADON和15ADON均未檢出，NIV檢出率最高達(dá)59.1%，DON僅有3個(gè)樣品檢出。比較不同糧食作物中單端孢霉烯族化合物（DON+3ADON+15ADON+NIV+4ANIV，trichothecenes）污染程度發(fā)現(xiàn)，小麥樣品中trichothecenes含量達(dá)（1 190±22.5）μg/kg，顯著高于玉米及水稻樣品（P＜0.05）。

表5 不同糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染情況Table 5 Contamination of Fusarium toxins in different cereals

2.4 不同取樣地區(qū)糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染水平

比較不同取樣地區(qū)糧食作物樣品中鐮刀菌毒素檢出情況發(fā)現(xiàn)（表6）：DON主要存在于小麥和玉米樣品中，僅在內(nèi)江地區(qū)3個(gè)水稻樣品中檢出DON毒素；NIV毒素在所有取樣地區(qū)均有檢出，且小麥中NIV檢出率高于玉米及水稻樣品。比較同一地區(qū)糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染程度發(fā)現(xiàn)：綿陽、德陽和資陽地區(qū)小麥中tirchothecenes含量分別為3 990.3、1 580.3 和 1 102.1 μg/kg，顯著高于當(dāng)?shù)氐挠衩准八緲悠罚≒＜0.05）。比較不同取樣地區(qū)糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染程度發(fā)現(xiàn)：綿陽、德陽及資陽小麥中tirchothecenes含量顯著高于其他地區(qū)的小麥、玉米及水稻樣品；除綿陽、德陽及資陽外其他主產(chǎn)區(qū)的小麥、玉米及水稻中tirchothecenes含量沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.5 種植制度對(duì)糧食產(chǎn)品中鐮刀菌毒素污染影響

比較同一種植制度下不同作物中鐮刀菌毒素污染程度（表7）：玉米-小麥套作方式下，小麥樣品中鐮刀菌毒素污染種類、檢出頻率均高于玉米樣品，小麥樣品中trichothecenes含量顯著高于玉米樣品（P＜0.05）；水稻-小麥輪作方式下，小麥樣品中鐮刀菌毒素污染種類、檢出頻率均高于水稻樣品，水稻中DON及其乙酰化衍生物均未檢出，小麥樣品中trichothecenes含量顯著高于前茬水稻樣品（P＜0.05）；水稻-再生稻種植方式下，水稻及再生稻樣品中鐮刀菌毒素種類均以NIV和4ANIV為主，再生稻樣品中NIV和4ANIV檢出率高于上一季水稻樣品，再生稻樣品中trichothecenes含量顯著高于水稻樣品（P＜0.05）。比較不同種植制度下鐮刀菌毒素污染情況：水稻-小麥輪作方式下小麥樣品中trichothecene含量顯著高于玉米-小麥套作的小麥樣品（P＜0.05）；水稻-小麥輪作下水稻中trichothecenes含量顯著高于水稻-再生稻種植方式下第一季水稻樣品（P＜0.05），與再生稻樣品中trichothecenes含量沒有顯著差異（P＞0.05）。

表7 不同種植制度下糧食作物樣品中鐮刀菌毒素污染水平Table 7 Concentration levels of Fusarium toxins in cereals from different planting systems

3 討論

本研究對(duì)2019年四川省311份糧食樣品中DON、3ADON、15ADON、NIV 和 4ANIV 等 5種鐮刀菌毒素污染規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，取樣地區(qū)糧食作物中鐮刀菌毒素污染種類以NIV為主，DON次之，NIV和DON平均含量顯著高于3ADON、15ADON及4ANIV（P＜0.05），不同取樣地區(qū)與糧食作物之間trichothecenes污染程度存在差異。盡管NIV在腸道毒性、細(xì)胞毒性等方面顯著高于DON[22-23]，但是國(guó)內(nèi)目前還沒有制定糧食作物產(chǎn)品中NIV毒素的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該予以高度關(guān)注。

Sun X.D.等[8]綜述了我國(guó)玉米中鐮刀菌毒素污染現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)河南、四川、江蘇和安徽等地玉米中檢出的trichothecenes主要以DON為主。與之類似，2019年四川省玉米樣品中trichothecenes檢出種類同樣以DON為主。但與Sun X.D.等[8]綜述結(jié)果不同的是，2019年四川省玉米樣品中NIV毒素含量明顯高于DON。Qiu J.B.等[9]綜述了我國(guó)小麥鐮刀菌毒素污染現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)小麥中trichothecenes檢出種類主要以DON為主，而在四川、重慶等地區(qū)以NIV為主。本研究結(jié)果與其一致，2019年四川省小麥trichothecenes污染同樣以NIV為主，NIV毒素含量顯著高于DON（P＜0.05）。Sun X.D.等[10]分析了我國(guó)水稻中真菌毒素污染現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)水稻樣品中真菌毒素種類主要以黃曲霉毒素為主，以DON和NIV為主的鐮刀菌毒素污染僅在廣西地區(qū)有所報(bào)道。Dong F.等[24]分析江蘇省水稻樣品中鐮刀菌毒素污染狀況時(shí)發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)trichothecenes污染種類主要以DON為主。盡管四川是我國(guó)最為重要的水稻產(chǎn)區(qū)之一[25]，但在水稻中鐮刀菌毒素污染規(guī)律研究報(bào)道相對(duì)較少[10]。本研究首次對(duì)四川省水稻樣品中鐮刀菌毒素進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)取樣地區(qū)水稻trichothecenes污染主要為NIV，僅有3個(gè)樣品檢出DON。

研究發(fā)現(xiàn)，水稻-小麥輪作方式下小麥中鐮刀菌毒素污染水平顯著高于玉米-小麥、大豆-小麥及棉花小麥等輪作方式下的小麥樣品[13，17]。本研究結(jié)果與前人一致，四川地區(qū)水稻-小麥輪作方式下的小麥樣品中trichothecenes含量顯著高于玉米-小麥套作方式下小麥樣品（P＜0.05）。四川作為西南地區(qū)典型的再生稻產(chǎn)區(qū)，再生稻對(duì)水稻產(chǎn)量增加、水稻經(jīng)濟(jì)效益提升等方面發(fā)揮了重要作用[26]，但水稻-再生稻種植方式對(duì)水稻中鐮刀菌毒素污染影響的研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本研究在掌握四川地區(qū)主要糧食作物中鐮刀菌毒素污染規(guī)律基礎(chǔ)上，首次分析了水稻-再生稻種植方式對(duì)水稻中鐮刀菌毒素污染的影響，發(fā)現(xiàn)水稻-再生稻種植方式會(huì)顯著增加再生稻中trichothecenes含量（P＜0.05）?？傮w而言，四川省小麥、玉米和水稻主要毒素污染種類為NIV毒素；通過適當(dāng)調(diào)整取樣地區(qū)主要糧食作物的種植制度，如減少水稻-小麥輪作或再生稻種植面積，將有助于四川省主要糧食作物中鐮刀菌毒素的污染控制。