結腸癌患者谷胱甘肽巰基轉移酶P1(GSTP1)基因多態(tài)性與奧沙利鉑敏感性和中醫(yī)證型的相關性研究

查華英,吳 巖,尚洛南,孫 方

查華英,吳巖,浙江省德清縣中醫(yī)院內科 浙江省湖州市 313200

尚洛南,浙江省德清縣中醫(yī)院影像科 浙江省湖州市 313200

孫方,浙江省德清縣中醫(yī)院放化療科 浙江省湖州市 313200

0 引言

流行病學調查顯示,結腸癌是全球第3大常見惡性腫瘤,其發(fā)生率隨飲食結構改變不斷增長,且5年生存率僅為50.0%[1-3].以奧沙利鉑為基礎的化療方案治療晚期結腸癌有效率為20.0%-30.0%,但其易產生外周神經(jīng)炎等不良反應,影響患者生存質量,甚至中斷治療進程[4,5].目前,中醫(yī)藥已成為結腸癌患者綜合治療的一個有效組成部分,在增強免疫功能、降低毒副反應、提高患者對化療耐受性、預防復發(fā)轉移等方面具有一定作用,但中晚期結腸癌的中醫(yī)證型缺乏統(tǒng)一的辨證標準[6].另外,生物醫(yī)學研究已表明[7],DNA損傷修復、藥物代謝及解毒等基因存在單核苷酸多態(tài)是藥物治療療效及耐受性個體差異的重要影響因素.谷胱甘肽巰基轉移酶P1(glutathione S-transferase P1,GSTP1)是人類谷胱甘肽S轉移酶家族主要成員,有學者認為,其不僅與化療藥物代謝具有密切聯(lián)系,也與結直腸癌發(fā)病及易感性有關[8],然而關于其與結腸癌患者中醫(yī)證型的相關性仍缺乏循證依據(jù),有待進一步深入探討.基于此,本研究嘗試分析結腸癌患者GSTP1基因多態(tài)性與奧沙利鉑敏感性和中醫(yī)證型的相關性.詳情如下.

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取我院2017-01/2020-06結腸癌患者118例,均行奧沙利鉑方案化療,其中女49例,男69例,年齡40-65歲,平均(53.25±3.69)歲.本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準,所有研究對象均簽署知情同意書.

納入標準:(1)均符合《2014 JSCCR指南:結直腸癌的治療》[9]中結腸癌診斷標準,并經(jīng)手術病理組織學檢查證實;(2)符合奧沙利鉑方案化療適應證;(3)臨床分期ⅢB-Ⅳ期;(4)中醫(yī)證型標準:參照《實用中醫(yī)腫瘤學》[10]和《中醫(yī)內科學》[11]進行中醫(yī)辨證分型,并均符合下述2項主癥或1項主癥、1項次癥、舌脈標準:①氣血雙虧型.主癥:腹痛綿綿,或腹內結塊,肛門重墜,大便帶血,泄瀉;次癥:形瘦納少,面色蒼白,唇甲不華;舌質淡,苔薄白,脈細弱無力;②濕熱蘊結型.主癥:腹部陣痛,下利赤白,里急后重,大便干稀不調,肛門灼熱;次癥:口干、發(fā)熱、納差、小便黃;舌質紅,苔黃膩,脈滑數(shù);③肝腎陰虛型.主癥:腹痛隱隱,腹內結塊,便秘,大便帶血為主癥;次癥:腰膝酸軟,頭暈耳鳴,口咽干燥,盜汗,形瘦納差;舌紅少苔,脈弦細數(shù);④瘀毒內阻型.主癥:腹脹刺痛拒按,下利紫黑膿血,量多;次癥:痛處拒按,煩熱口渴,唇甲青紫或有肌膚甲錯;舌質黯或有瘀斑、瘀點,苔黃,脈澀;⑤脾腎陽虛型.主癥:腹痛喜溫喜按,下利清谷,五更泄瀉,見大便帶血;次癥:面色蒼白或萎黃,少氣無力,畏寒肢冷,腰酸膝冷;舌質淡胖有齒痕,苔薄白,脈沉細弱.

排除標準:(1)合并肝腎等其他重要臟器器質性病變者;(2)預計生存期＜6 mo;(3)存在奧沙利鉑、亞葉酸鈣、5-氟尿嘧啶等藥物過敏史者;(4)凝血機制紊亂或活動性出血者;(5)精神失常者.

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:自制臨床資料調查問卷(經(jīng)預試驗,本問卷內部一致性信度Cronbach's α系數(shù)為0.85,內容效度為0.92),收集患者年齡、性別、腫瘤直徑、卡氏評分(karnofsky performance scale,KPS)、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移等資料,其中KPS評分包括功能狀況、體力狀況兩部分,總分0-100分,得分與生活質量呈正相關.

1.2.2 奧沙利鉑方案化療:(1)67例采用改良FOLFOX4方案:d1,靜脈滴注奧沙利鉑(海南錦瑞制藥有限公司,國藥準字H20143023,規(guī)格:50 mg)130 mg/m2,持續(xù)靜脈滴注120 min;d1-5,靜脈滴注亞葉酸鈣[江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司,國藥準字H20060198,規(guī)格:50 mg(按亞葉酸計)]130 mg/m2,持續(xù)靜脈滴注120 min,同時靜脈滴注5-氟尿嘧啶(遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司,國藥準字H20051138,規(guī)格:0.5 g)300 mg/m2,持續(xù)靜脈滴注240 min,21 d為1個周期.(2)51例采用Xelox方案:d1,靜脈滴注奧沙利鉑130 mg/m2,持續(xù)靜脈滴注120 min;d1-14,口服卡培他濱(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司,國藥準字H20143044,規(guī)格:0.5 g)250 mg/m2,2次/d,21 d為1個周期.

1.2.3 GSTP1基因多態(tài)性檢測:所有研究對象化療前均留取2 mL靜脈血,置于乙二胺四乙酸抗凝管中,嚴格按照賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA,采用北京海天友誠科技有限公司提供的752N型紫外分光光度計測定DNA純度.GSTP1基因片段PCR擴增引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,引物序列如下:上游引物:5’-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3’;下游引物:5’-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3’;探針引物1(FAM):5’-GCAAATACATCTCCCTCA-3’;探針引物2(HEX):5’-GCAAATACGTCTCCCTCA-3’.PCR擴增體系:總共25 μL,分別為Nucleasee-free Water 9.25 μL,GSTP1上、下游引物、探針引物各0.5 μL,Premix Taq 12 μL,基因組DNA 1 μL,二甲基亞砜1.25 μL.PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;72 ℃ 2 min;94 ℃變性30 s,63.4 ℃低溫復性30 s,72 ℃退火延伸30 s,共40個循環(huán).每個循環(huán)結束時,自動檢測熒光信號.分型結果由儀器自動生成.

表 1 奧沙利鉑化療不同療效患者臨床資料

1.2.4 質量控制:上述操作均由接受專業(yè)培訓后質檢人員進行統(tǒng)計與檢測,并簽署患者信息保密書,以保證數(shù)據(jù)安全性,保護患者隱私問題.

1.3 療效判定標準 化療3個周期后所有患者均接受CT檢查,采用單徑測量法測定腫瘤直徑、垂直徑,并參照RECIST標準[12]評估兩組治療效果.完全緩解(complete response,CR):腫瘤完全消失,維持≥4 wk;部分緩解(partial response,PR):腫瘤最大直徑與最大垂直徑乘積減少＞50.0%,并維持≥4 wk;疾病穩(wěn)定(stable disease,SD):介于PR、疾病進展(progressive disease,PD);PD:腫瘤最大直徑與最大垂直徑乘積增加＞25.0%,或出現(xiàn)新病灶.總有效率=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%.

1.4 觀察指標 (1)統(tǒng)計GSTP1基因型分布情況;(2)分析奧沙利鉑化療療效,并比較不同化療療效患者臨床資料;(3)比較不同化療療效患者GSTP1基因型分布情況;(4)分析結腸癌患者奧沙利鉑化療療效的影響因素;(5)統(tǒng)計結腸癌患者中醫(yī)證型分布情況;(6)分析GSTP1基因型與中醫(yī)證型的關系;(7)GSTP1基因型與中醫(yī)病位證素的關系.

統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與夏皮羅-威爾克正態(tài)性檢驗,均確認具備方差齊性且近似服從正態(tài)布,以mean±SD描述,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料用n(%)表示、χ2檢驗,等級資料用u表示、Ridit檢驗;影響因素采用Logistic多因素回歸分析.均采用雙側檢驗,α=0.05.

2 結果

2.1 GSTP1基因型分布情況 GSTP1基因Ile105Val位點經(jīng)Taqman-PCR法檢測顯示:野生純合型(AA)、突變雜合型(AG)、突變純合型(GG),PCR擴增目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,隨機選取10%樣本進行基因測序驗證,使用BioEdit version 5.0.6軟件查看測序結果,證實GSTP1基因Ile105Val位點存在多態(tài)性.PCR產物電泳圖見圖1.本研究246例樣本中,共檢測到140例AA,82例AG,24例GG,多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗,具有人群代表性(P＞0.05).

2.2 奧沙利鉑化療療效及不同療效患者臨床資料 246例結腸癌患者經(jīng)奧沙利鉑方案化療3個周期后,CR 0例,PR 58例,SD 50例,PD 138例,總有效率為43.90%(108/246).有效患者年齡、性別、腫瘤直徑、KPS評分與無效患者差異無統(tǒng)計學意義;有效患者臨床分期、分化程度、淋巴結轉移與無效患者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表1.

表 2 不同化療療效患者GSTP1基因型分布情況

表 3 奧沙利鉑化療療效的影響因素

表 4 GSTP1基因型與中醫(yī)證型的關系

表 5 GSTP1基因型與中醫(yī)證素的關系

2.3 不同化療療效患者GSTP1基因型分布情況 Ridit檢驗,有效患者GSTP1基因型分布情況與無效患者存在顯著差異(P＜0.05),見表2.

圖 1 分型結果散點圖.

2.4 奧沙利鉑化療療效的影響因素 以奧沙利鉑化療療效為因變量(有效=0,無效=1),以臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、GSTP1基因型作為自變量(臨床分期:ⅢB期=1,Ⅳ期=2;分化程度:低分化=1,中高分化=2;淋巴結轉移:否=0,是=1;GSTP1基因型引入啞變量賦值:AA=1,AG=2,GG=3),Logistic回歸分析,Ⅳ期結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是ⅢB期患者的2.730倍;中高分化結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是低分化患者的0.558倍;有淋巴結轉移的結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是無淋巴結轉移的4.570倍;GSTP1基因型AG的結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是AA患者的0.470倍,GSTP1基因型GG的結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是AA患者的0.502倍(P＜0.05),見表3.

2.5 結腸癌患者中醫(yī)證型分布情況 118例結腸癌患者中醫(yī)證型分布情況:瘀毒內阻型＞脾腎陽虛型＞氣血雙虧型＞濕熱蘊結型＞肝腎陰虛型,詳見圖2.

2.6 GSTP1基因型與中醫(yī)證型的關系 瘀毒內阻型、氣血雙虧型患者GSTP1基因型分布存在顯著差異(P＜0.05),脾腎陽虛型、濕熱蘊結型、肝腎陰虛型患者GSTP1基因型分布差異無統(tǒng)計學意義;不同GSTP1基因型分布患者中醫(yī)證型分布差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);見表4.

2.7 GSTP1基因型與中醫(yī)病位證素的關系 不同GSTP1基因型患者中醫(yī)病位證素脾、肺、腎分布差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表5.

3 討論

由于中晚期結腸癌患者病灶通常無法徹底切除,姑息性切除適應證少,故化療是其治療首選方案,但化療方案較多,并非所有患者均能從特定化療方案中獲益[13,14],因此,明確影響結腸癌化療療效因素,有助于指導臨床擬定針對性化療方案.

3.1 結腸癌奧沙利鉑化療療效與GSTP1基因多態(tài)性的關聯(lián)性 GSTP1屬Ⅱ相代謝酶,可結合親電子細胞毒藥物,提高親電子細胞毒藥物水溶性,調控化療藥物代謝[15-17],Ile105Val是其最為常見的一種多態(tài),可降低GSTP1酶穩(wěn)定性及催化活性.本研究中,246例結腸癌患者GSTP1基因Ile105Val位點符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,可見納入患者具有良好群體代表性.另外,閆晉等[18]研究證實,與突變型編碼的GSTP1酶解毒活性比較,GSTP1 Ile105Va野生型編碼的GSTP1酶解毒活性可上調2-3倍.本研究經(jīng)Logistic多因素回歸分析,GSTP1基因型AG、GG是結腸癌患者奧沙利鉑化療效果的保護因素,這可能歸因于GSTP1酶作為調控鉑類藥物代謝的重要酶,其突變后可明顯減弱GSTP1酶結合奧沙利鉑的能力,抑制奧沙利鉑代謝排出,進而增強機體對鉑類藥物的敏感性.由此可見,GSTP1基因可能是結腸癌奧沙利鉑敏感性的標志之一.但McLeod等[19]通過520例晚期大腸癌患者卻發(fā)現(xiàn),GSTP1 GG基因型患者因神經(jīng)毒性可能終止FOLFOX方案化療進程,與本研究結果存在一定差異,可能與種族、地域不同有關.另外,在評估奧沙利鉑化療療效的同時還應將臨床分期、分化程度、淋巴結轉移等因素納入考慮范圍內,以減少研究結果偏移.

3.2 結腸癌中醫(yī)證型與GSTP1基因多態(tài)性的關系 目前結腸癌中醫(yī)證型尚無統(tǒng)一標準.方漢欽[20]研究認為,結腸癌臨床分期為Ⅲ期、Ⅳ期患者以虛證多見,主要表現(xiàn)為氣滯血瘀證.另有學者指出[21],大腸癌證候演變多是由實轉虛,隨病情演變,正邪膠著日久,腫瘤末期臟腑機能損傷,氣血津液損傷,故虛證是大腸癌晚期常見證型.本研究將結腸癌分為5種中醫(yī)證型,其中證型分布以虛證為多見,尤以脾腎陽虛型多見,實證分布以瘀毒內阻型最為多見,考慮其原因可能與結腸癌病理機制存在一定相關性,本虛標實是結腸癌病機,素體虧虛是其內因,邪氣外侵是其外因,正氣虛衰,致使邪氣留滯不去,脾虛運化無力,痰濕結聚體內,氣血運化不暢,日久化熱,與瘀、毒搏結日久而致病.另有學者通過分析GSTP1遺傳多態(tài)性型發(fā)現(xiàn)[22],AA、AG及GG 3種基因型患者兼夾脾證素頻率逐一減小,說明GSTP1基因多態(tài)性可能影響結直腸癌術后患者氣虛證兼夾.本研究結果表明,GSTP1基因AG、GG患者中醫(yī)證型以瘀毒內阻型為多,且不同GSTP1基因型分布患者中醫(yī)證型分布、中醫(yī)病位證素脾、肺、腎分布比較,差異有統(tǒng)計學意義,由此推測,結腸癌患者GSTP1基因多態(tài)性與中醫(yī)證型存在一定相關性,這可能與不同GSTP1基因型對基因產物酶活性或代謝底物親和性的影響不一,從而誘導患者出現(xiàn)不同中醫(yī)證型易患趨勢有關,同時,不同中醫(yī)證型奧沙利鉑化療敏感性不一可能也是上述結果出現(xiàn)的原因之一.

圖 2 結腸癌患者中醫(yī)證型分布情況.

4 結論

綜上可知,結腸癌患者GSTP1基因多態(tài)性與奧沙利鉑敏感性和中醫(yī)證型均存在一定相關性,因此檢測GSTP1基因多態(tài)性,有助于評價患者接受以奧沙利鉑為基礎藥物化療的治療效果,判斷中醫(yī)證型,從而為結腸癌個體化治療提供科學指導.

文章亮點

實驗背景

目前對于結腸癌的治療,比較有效的還是常規(guī)手術和藥物化療,但是由于受遺傳因素的影響,基因型不同人群可能對化學藥物的敏感性不同.同時,中醫(yī)對癌癥的輔助治療也可能受到遺傳因素的作用,而產生不同的治療效果.

實驗動機

本研究試圖探討遺傳因素之基因多態(tài)性對化療藥物敏感性和中醫(yī)證型之間的聯(lián)系,為結腸癌患者的更有效治療提供基因分型的依據(jù)和化療藥物的使用指導.

實驗目標

本研究旨在通過對GSTP1基因進行分型,建立結腸癌患者對奧沙利鉑敏感性和中醫(yī)證型關系的模型,從而確定不同基因型的患者對同樣化療藥物以及中醫(yī)證型的敏感程度,為結腸癌患者的靶向治療提供借鑒和依據(jù).

實驗方法

本研究主要采用數(shù)據(jù)分析的方法,分析結腸癌患者奧沙利鉑化療療效的影響因素,統(tǒng)計并分析GSTP1基因型與中醫(yī)證型和中醫(yī)病位證素的關系,分別從中醫(yī)和西醫(yī)兩方面來闡述GSTP1基因型對腸癌患者治療效果的影響.

實驗結果

GSTP1基因型AG的結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是AA患者的0.470倍,GSTP1基因型GG的結腸癌患者發(fā)生奧沙利鉑化療無效的風險可能是AA患者的0.502倍.不同GSTP1基因型分布患者中醫(yī)證型分布,中醫(yī)病位證素脾、肺、腎分布均有顯著差異.

實驗結論

結腸癌患者GSTP1基因多態(tài)性與奧沙利鉑敏感性有關,和中醫(yī)證型也有一定的相關性,有助于評價患者是否適用于接受奧沙利鉑等鉑類物化療藥進行治療,判斷中醫(yī)證型,指導結腸癌的個體化治療.

展望前景

本研究是基于統(tǒng)計學方法建立模型來研究,同時大部分患者均來自周邊,因此受到地域和樣本量等因素的影響,要反映整體中國或漢族人群的情況,還有待進一步擴大其他地域的樣本量來進一步驗證.