miR-34a-5p對(duì)KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

吳淑媛，曹冬冬，李冬梅,張曉艷，徐慧玲，李英，潘澤民，李冬妹*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師石河子市婦幼保健院，新疆 石河子 832000)

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)，又稱(chēng)人類(lèi)皰疹病毒8型(Human herpes virus，HHV-8)，流行病學(xué)研究證實(shí)該病毒是卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma，KS)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(Primary effusion lymphoma，PEL)及多中心卡斯特曼病(Multicentric castleman disease，MCD)的病原體[1]。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們對(duì)KSHV的致病性及其分子機(jī)制的研究已取得較大進(jìn)展。

KSHV感染的生命周期包含兩個(gè)階段，一為短暫的裂解復(fù)制，二為持續(xù)的潛伏感染。在裂解復(fù)制期大量宿主細(xì)胞溶解、死亡，而潛伏感染則引起宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成，這兩種感染方式存在反饋性調(diào)節(jié)并且可以相互轉(zhuǎn)化。目前已知KSHV感染的細(xì)胞類(lèi)型為上皮細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，且KSHV陽(yáng)性細(xì)胞絕大部分處于潛伏感染狀態(tài)，需要誘導(dǎo)進(jìn)入裂解態(tài)。我們課題組在前期研究中，證實(shí)了KSHV可以感染神經(jīng)細(xì)胞，并同時(shí)表達(dá)潛伏和裂解態(tài)的病毒基因[2]。

MicroRNAs(miRNAs)是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，可通過(guò)結(jié)合mRNA 的3'UTR區(qū)調(diào)控基因的表達(dá)[3]。在本研究中為尋找KSHV感染神經(jīng)細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，我們采用KSHV感染與未感染的神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的c-fos在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且促進(jìn)病毒基因表達(dá)的過(guò)程[4]，在測(cè)序結(jié)果中分析與c-fos表達(dá)調(diào)控相關(guān)并能夠影響KSHV感染神經(jīng)細(xì)胞的生命特征的miRNA，檢測(cè)了miR-34a-5p在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)，以及對(duì)增殖、遷移和c-fos的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)基、嘌呤霉素、BI血清、胰蛋白酶、雙抗(青霉素-鏈霉素)均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；脂質(zhì)體Lip2000購(gòu)于美國(guó) Invitrogen公司；20×PBS購(gòu)于上海生工公司；DMSO、MTT均購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司；miR-34a-5p mimics、miR-NC、pmirGLO-c-fos-wt、pmirGLO-c-fos-mut購(gòu)于上海吉瑪公司；Trizol試劑購(gòu)于上海ambion公司；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于中國(guó)TakaRa公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司；雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；鼠抗人c-fos購(gòu)于中國(guó)博奧森公司；山羊抗鼠IgG 購(gòu)于北京中杉金橋公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad生物工程公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司；高速冷凍離心機(jī)和CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

于液氮凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后，將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，SK-RG細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、6 μg·mL-1嘌呤霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行換液及傳代處理，傳代至少3次后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

提取SK-RG和SH-SY5Y細(xì)胞的RNA，于深圳華大生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)細(xì)胞3個(gè)重復(fù)樣品，將測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，比對(duì)高質(zhì)量數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)整合，篩選并分析差異表達(dá)的miRNA。在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)的miRNA數(shù)據(jù)集合中，使用RNAhybrid、miRanda、TargetScan 3種軟件預(yù)測(cè)其中可調(diào)控c-fos的miRNA，取交集，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，最終選擇fold change值高，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義強(qiáng)的miR-34a-5p開(kāi)展后續(xù)研究。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)

常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y、SK-RG細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，采用 Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，按照日本TaKaRa公司的Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算RNA加樣量，合成cDNA。

獲得的cDNA 再進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；70 ℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-RG細(xì)胞鋪板，16～24 h內(nèi)使用 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑分別將A液100 μL DMEM 加入2.5 μL的miR-34a-5p mimics，B液100 μL DMEM中加入2.5 μL的miR-NC，C液100 μL DMEM 加入3.5 μL的lip2000，靜置5 min后，將C液分別加入到A、B中混勻，靜置20 min。棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用1×PBS洗兩遍，加入1 mL DMEM，將混合液梅花樣點(diǎn)入細(xì)胞中，4～6 h進(jìn)行換液,繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics、miR-NC的SK-RG細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用胰酶消化后進(jìn)行離心，1 000 r·min-1，5 min。用1 mL培養(yǎng)基進(jìn)行重懸并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板，每孔總液量為100 μL，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔進(jìn)行培養(yǎng)(邊緣用1×PBS填充)，分別在24、48、72、96、120 h檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在第24 h每孔加入20 μL MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL DMSO振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用胰酶消化后進(jìn)行離心。取1 mL培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，每孔300個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每孔再加入2 mL的培養(yǎng)液，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，繼續(xù)培養(yǎng)12 d，每隔3～4 d換液，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

棄去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗兩遍，加入4%多聚甲醛固定40 min，0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，30 min后1×PBS再次清洗兩遍。將培養(yǎng)板置于室溫晾干，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)每組細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，用1 mL滅菌槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。用1×PBS洗滌兩次，加入2%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、12、36 h拍照并標(biāo)記拍照位置。

1.2.8 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

消化轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，加入1 mL 1×PBS 和DMEM洗滌，用DMEM重懸并計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)到3×105mL，向上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10% FBS培養(yǎng)基。在顯微鏡下觀察上、下室之間沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，放入37 ℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出。吸去上、下室培養(yǎng)液，1×PBS清洗2遍，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。下室加入1 mL的4%多聚甲醛固定40 min，用棉簽擦拭上室內(nèi)部。棄去下室液體，并加入0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色30 min，回收結(jié)晶紫，用流水緩緩沖去染液，再次用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干上室水分。倒置顯微鏡上放置載玻片，將小室放在上面進(jìn)行拍照。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用生物信息學(xué)軟件TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-34a-5p 與c-fos 基因3'UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型和突變型c-fos 3'UTR區(qū)質(zhì)粒載體(pmirGLO-c-fos-wt、pmirGLO-c-fos-mut)。單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics和miR-NC于293T細(xì)胞中，鑒定轉(zhuǎn)染效率并確定最佳轉(zhuǎn)染劑量。之后將pmirGLO-c-fos-wt、pmirGLO-c-fos-mut分別與最佳劑量的miR-34a-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，標(biāo)記為miRNA-NC+c-fos 3'UTR-wt組、miRNA-34a-5p+c-fos 3'UTR-wt組、miRNA-NC+c-fos 3'UTR-mut組和miRNA-34a-5p+c-fos 3'UTR-mut組。置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集并裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.10 Western blot檢測(cè) c-fos的表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics和miR-NC后48 h，棄去原培養(yǎng)基，加入1×PBS洗兩遍，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液(RIPA:PMSF=100∶1)，冰上靜置30 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，12 000 r·min-1，20 min離心后收集上清液，對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)量后，加入1/4蛋白樣品體積的5×loading buffer 100 ℃，10 min 進(jìn)行煮沸。計(jì)算上樣量，上樣至濃縮膠孔中，80 V恒壓30 min后調(diào)至110 V，60 min。蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，60 min后取出PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，封閉處理120 min。加入一抗(GAPDH、c-fos稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜后洗膜，110 r·min-110 min，洗3次。加入二抗(稀釋比1∶10 000)37 ℃孵育120 min，再次洗膜。經(jīng)發(fā)光劑顯影后，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Prism5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)篩選差異表達(dá)miRNA

在感染和未感染KSHV的神經(jīng)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出差異表達(dá)的miRNA，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA共有1462條，表達(dá)下調(diào)的miRNA共有152條(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選差異表達(dá)的miRNA

進(jìn)一步分析miRNA和mRNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)性。在表達(dá)下調(diào)的miRNA中，采用RNAhybrid、miRanda、TargetScan 3種軟件預(yù)測(cè)其中調(diào)控c-fos的miRNA，取交集，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p可能調(diào)控c-fos基因的表達(dá)(圖2)。

圖2 差異表達(dá)miRNA中靶向調(diào)控c-fos基因的預(yù)測(cè)

2.2 驗(yàn)證miR-34a-5p在SK-RG中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與未感染KSHV的神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y相比，miR-34a-5p在SK-RG細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 7，N=3，圖3)。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)miR-34a-5p水平

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a-5p 對(duì)SK-RG細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，接種細(xì)胞48 h后，miR-34-5p組細(xì)胞的增殖活力開(kāi)始低于miR-NC組，且隨著時(shí)間的推移，差異愈加明顯，在96小時(shí)開(kāi)始差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.001，N=3(圖4)。

圖4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)SK-RG細(xì)胞增殖能力的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-34-5p組細(xì)胞集落數(shù)少于miR-NC組。此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-34-5p能夠抑制SK-RG細(xì)胞的增殖能力P<0.0001，N=3(圖5)。

圖5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)SK-RG細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示在轉(zhuǎn)染miR-34-5p mimics，miR-NC后，miR-34-5p組中的細(xì)胞遷移距離、遷移率均低于對(duì)照組P<0.01，N=3(圖6)。

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

2.6 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)SK-RG細(xì)胞遷移能力的影響

轉(zhuǎn)染36 h后分別計(jì)數(shù)Transwell實(shí)驗(yàn)各組穿膜細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示miR-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)多于miR-34a-5p組，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-34-5p mimics細(xì)胞遷移能力減低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.000 1，N=3(圖7)。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-34-5p能夠抑制細(xì)胞的遷移能力。

圖7 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-34-5p對(duì)c-fos的靶向調(diào)控作用

采用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)miR-34a-5p與c-fos 基因3 'UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)(圖8)，接下來(lái)我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-NC+c-fos 3'UTR-mut共轉(zhuǎn)染組和miRNA-34a-5p+c-fos 3'UTR-mut共轉(zhuǎn)染組熒光素酶的活性未見(jiàn)明顯變化，而miRNA-NC+c-fos 3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染組、miRNA-34a-5p+c-fos 3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染組熒光素酶的活性出現(xiàn)變化P=0.003，N=3(圖9)。這些結(jié)果表明miR-34-5p與c-fos具有靶向關(guān)系。

圖8 預(yù)測(cè)miR-34-5p與c-fos 3’UTR的靶向調(diào)控位點(diǎn)

圖9 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-34a-5p與c-fos的靶向關(guān)系

2.8 Western blot檢測(cè)c-fos表達(dá)

SK-RG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics、miR-NC后Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-34a-5p后c-fos蛋白表達(dá)水平低于miR-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.004 9，N=3(圖10)。

圖10 Western blot檢測(cè) c-fos蛋白表達(dá)水平

3 討論

許多miRNA已被發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)癌細(xì)胞中特異性調(diào)控失調(diào)，其中一些下調(diào)的miRNA具有腫瘤抑制基因的功能，而上調(diào)的miRNA則具有促腫瘤活性[5-7]。隨著對(duì)miRNA在癌癥生物學(xué)中的認(rèn)識(shí)不斷深入，以miRNA為基礎(chǔ)的治療策略正在興起。

我們前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及與mRNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞中與c-fos負(fù)相關(guān)，呈低表達(dá)。最新研究也發(fā)現(xiàn)miR-34a家族成員miR-34a-5p 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和侵襲[8]。miR-34a-5p可以通過(guò)靶向調(diào)節(jié)HPV感染的人類(lèi)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的JAG1/Notch1途徑抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。miR-34a-5p還可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)HMGA2，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。生物工程miR-34a-5p前體藥在體內(nèi)可以抑制尤文氏肉瘤生長(zhǎng)。我們發(fā)現(xiàn)了miR-34a-5p在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，然而，其對(duì)此類(lèi)細(xì)胞的作用和機(jī)制仍不明確。為進(jìn)一步分析miR-34a-5p在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，我們?cè)赟K-RG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics后使得miR-34a-5p過(guò)量表達(dá)，然后檢測(cè)細(xì)胞增殖和遷移能力，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)的miR-34a-5p能夠抑制KSHV感染的SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移傾向。

目前認(rèn)為 microRNA 可以通過(guò)識(shí)別靶基因 mRNA 的 3'UTR區(qū)發(fā)揮作用，并以完全或不完全的方式與互補(bǔ)序列結(jié)合，破壞mRNA的穩(wěn)定性，抑制 mRNA的翻譯，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)[11-12]。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)c-fos在KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且影響病毒的致病性和細(xì)胞的增殖[3]，c-fos的表達(dá)上調(diào)可能涉及其上游的miRNA水平的改變，而生物軟件預(yù)測(cè)miR-34a-5p能夠靶向調(diào)控c-fos的表達(dá)。c-fos是一個(gè)核磷蛋白，其在上皮細(xì)胞中可激活KSHV病毒的裂解態(tài)分子開(kāi)關(guān)ORF50[13]，也有研究發(fā)現(xiàn)c-fos與KSHV病毒的多個(gè)啟動(dòng)子直接結(jié)合，激活多種病毒基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]。c-fos同時(shí)也是神經(jīng)元被刺激激活的一種標(biāo)志，在神經(jīng)元活化、突觸可塑性及神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[16]。我們通過(guò)生物信息學(xué)軟件進(jìn)一步預(yù)測(cè)了miR-34a-5p與c-fos 3'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和miR-34a-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞中c-fos的表達(dá)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了miR-34a-5p對(duì)c-fos的靶向調(diào)節(jié)作用。KSHV可能在其感染的神經(jīng)細(xì)胞中通過(guò)下調(diào)miR-34a-5p的水平而導(dǎo)致c-fos蛋白的表達(dá)增高，從而進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，我們證明了miR-34a-5p能夠抑制KSHV感染的神經(jīng)細(xì)胞的增殖和遷移能力，其機(jī)制涉及對(duì)靶基因c-fos的調(diào)控。在進(jìn)一步的研究中，我們將檢測(cè)KSHV是否調(diào)控miR-34a-5p的水平，以及上調(diào)miR-34a-5p 對(duì)KSHV感染相關(guān)疾病的逆轉(zhuǎn)作用，從而為 KSHV 感染引起的疾病的靶向治療奠定基礎(chǔ)。