復(fù)合微生物菌劑對玉米秸稈的預(yù)處理與厭氧產(chǎn)氣性能的研究

李靖，董良杰，崔彥如，趙葉明，趙勝楠，高海，何自涵

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124；3 南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 南充 637000)

秸稈是世界上最為豐富的物質(zhì)之一,是糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，其中含有豐富的氮、磷、鉀、微量元素等成分。我國年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈7億多噸，約占世界年秸稈產(chǎn)量的30%[1]，其中玉米秸稈2.5億噸，東北地區(qū)年玉米產(chǎn)量1億噸以上，年產(chǎn)秸稈達(dá)1.1噸左右，占全國玉米秸稈資源的40%～50%。玉米秸稈含有豐富的碳水化合物、礦物質(zhì)及粗蛋白等營養(yǎng)成分，玉米秸稈中60%以上的碳水化合物、2%～4%的蛋白質(zhì)、0.5%～1%的脂肪，纖維素、半纖維素與木質(zhì)素約占38%、24%、18%，是一種可供開發(fā)與綜合利用的資源之一[2]。全國至少仍有1/3的秸稈沒有被合理的利用，我國大多采用直接燃燒的方式進(jìn)行處理，由此帶來環(huán)境污染、火災(zāi)事故、土壤礦化等一系列問題。

吉林省作為我國重要的糧食生產(chǎn)基地，玉米是主要的農(nóng)業(yè)作物，據(jù)2015年統(tǒng)計(jì)，吉林省玉米秸稈年產(chǎn)量4 000萬噸，其中肥料化還田占40%～55%，12%～15%用于飼料化(部分畜牧養(yǎng)殖區(qū)比例上浮)，8%～12%用于燃料化(包括農(nóng)村冬季取暖)，1%～3%用于基料化，仍有近30%以上沒有實(shí)現(xiàn)資源化利用，大量的玉米秸稈直接焚燒，一方面造成資源浪費(fèi)，另一方面也造成大量的區(qū)域污染[3]。玉米秸稈成分結(jié)構(gòu)致密，其所含的纖維素、半纖維與木質(zhì)素更是難以被微生物降解，在自然條件下降解玉米秸稈則需要很長一段時(shí)間[4]，要在厭氧發(fā)酵前進(jìn)行預(yù)處理工作，根據(jù)目前研究現(xiàn)狀分析，利用微生物預(yù)處理玉米秸稈水解玉米秸稈中的有機(jī)物質(zhì)已成為一種有效的解決辦法。微生物預(yù)處理技術(shù)是利用外加的具有生物活性的酶，利用單一的菌株或復(fù)合的菌群在前期預(yù)處理中加快玉米秸稈的分解，利用微生物預(yù)處理技術(shù)后不僅能降低耗能、避免二次污染，還可以在后續(xù)厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用，而且對于纖維素、半纖維素與木質(zhì)素也可起到一定的降解作用[5]。

本文將采用乳酸菌、EM菌劑、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉，共計(jì)6中微生物菌劑復(fù)合用于玉米秸稈的前期預(yù)處理試驗(yàn)中，通過試驗(yàn)以期達(dá)到玉米秸稈的高效水解與高效的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣的技術(shù)，為農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化、能源化利用提供新的解決措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈：取自吉林省農(nóng)科院玉米試驗(yàn)田，經(jīng)過田間自然曬干，后經(jīng)過揉搓曝氣處理，使粒徑為0.7～1 cm。玉米秸稈預(yù)處理微生物：來自市面上出售的乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉經(jīng)過微生物培養(yǎng)后接種使用。牛糞：取自吉林省農(nóng)科院畜牧分院養(yǎng)殖場。試驗(yàn)原料與接種物基本性質(zhì)如表1所示。

表1 試驗(yàn)原料與接種物基本性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)裝置與儀器

1.2.1 試驗(yàn)裝置

本試驗(yàn)主要可分為微生物預(yù)處理試驗(yàn)與厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn)兩部分，且兩部分均獨(dú)立完成。微生物預(yù)處理試驗(yàn)是將培養(yǎng)后的乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉與揉搓曝氣處理后的玉米秸稈按比例混合后室溫下25 ℃條件下進(jìn)行儲存。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣階段將采用自制厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣系統(tǒng)，如圖1所示，使其在35 ℃、TS為15%的條件下進(jìn)行中溫發(fā)酵。

圖1 厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn)裝置

1.2.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備

島津分析天平AUY系列 AUY220電子分析天平(日本島津有限公司)、DHP-9402電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海華零實(shí)業(yè)有限公司)、FEI Quanta FEG 650 掃描電子顯微鏡(賽默飛材料與結(jié)構(gòu)分析電鏡事業(yè)部)、TGL-16G 高速冷凍離心機(jī)(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)、HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)、101系列 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(北京東信力搏科技有限公司)、i7 紫外可見光光度計(jì)(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)、DZS-708型 多參數(shù)分析儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、HW-1340 超凈工作臺(東莞市弘維凈化科技有限公司)、YXQ-LS-75SII 立式蒸汽壓力滅菌器(北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司)、GC-2014C氣相色譜(日本島津有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)

1.3.1 菌劑的預(yù)處理

(1)培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：稱取39 g固體培養(yǎng)基粉末溶于1 L水中，121 ℃滅菌15 min。

(2)菌種培養(yǎng)。孢子懸浮液的制備：將以上菌種活化后移至PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)4～6 d，至長滿孢子時(shí)用用無菌水沖洗至三角瓶中，加入滅菌玻璃珠，在200 r·min-1的振蕩器中震蕩30 min，取出，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[6]，調(diào)整至每種菌種的孢子數(shù)在106mL-1。

復(fù)合微生物菌劑CM-2：將以上菌種的孢子懸浮液按照體積比為1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合。

復(fù)合微生物預(yù)處理玉米秸稈：每1 kg上述揉搓曝氣處理后的玉米秸稈接種80 mL上述制備好的復(fù)合微生物菌劑，室溫25 ℃儲存?？瞻讓φ战M則采用揉搓曝氣處理后的玉米秸稈，其他不做任何處理，室溫25 ℃。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈保存30 d，每天設(shè)置2個(gè)重復(fù)共3組平行試驗(yàn)，空白對照試驗(yàn)組選取經(jīng)過上述揉搓曝氣處理后的同一批玉米秸稈并且不添加任何微生物菌劑與其它處理的條件下重復(fù)上述過程。室溫下保存，每天取樣，共計(jì)30天，分別對其pH、還原糖、纖維素、半纖維素與木質(zhì)素進(jìn)行測定。

厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣階段是將每天處理后的玉米秸稈與新鮮牛糞，按照干物質(zhì)比為1∶2，TS為15%，發(fā)酵溫度為35 ℃，加入經(jīng)過充分發(fā)酵后的沼液調(diào)節(jié)至有效體積至0.8 L，進(jìn)行35 d中溫批次厭氧發(fā)酵試驗(yàn)?？瞻讓φ战M的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣原料取自上述預(yù)處理試驗(yàn)中的空白對照組的玉米秸稈重復(fù)上述處理步驟。每組試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)，每隔2 d測定其產(chǎn)氣量與氣體成分。

1.4 分析方法

TS、VS 測定參照重量測定方法。利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[7]與紫外分光光度計(jì)測定預(yù)處理后的玉米秸稈的還原糖；使用多參數(shù)分析儀測定不同預(yù)處理時(shí)間后的玉米秸稈的pH 值[8]；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素采用洗滌滴定法[9]。采用排水集氣法收集氣體，每隔2天定時(shí)測量厭氧反應(yīng)器中排出的水量，即為沼氣的產(chǎn)氣量(mL)，同時(shí)利用氣相色譜儀對產(chǎn)氣進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合微生物菌劑預(yù)處理

2.1.1 復(fù)合微生物菌劑預(yù)處理玉米秸稈不同時(shí)間對pH變化的影響

經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2以及空白對照組的預(yù)處理后的玉米秸稈測定其在不同處理天數(shù)時(shí)的pH值，如圖2所示，經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理的玉米秸稈其pH變化基本呈現(xiàn)先迅速下降后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)，而空白對照組的玉米秸稈其pH值基本保持穩(wěn)定。經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈其pH從開始的6.8下降至后期的3.9，說明經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在預(yù)處理期間進(jìn)行了部分水解，有乙酸等揮發(fā)性酸的產(chǎn)生，第3天～第21天，pH下降速率快，說明在此過程中有酸性物質(zhì)的積累，至第21天～第29天時(shí)，能被復(fù)合微生物菌劑CM-2消耗的有機(jī)質(zhì)成分以基本消耗完畢，同時(shí)水解產(chǎn)生的酸類物質(zhì)也為后續(xù)的厭氧發(fā)酵提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 玉米秸稈pH變化圖

2.1.2 復(fù)合微生物菌劑預(yù)處理玉米秸稈對纖維素、半纖維素與木質(zhì)素含量的影響

纖維素主要是由葡萄糖分子通過1,4-β糖苷鍵鏈接聚合而成的高分子化合物，水解多產(chǎn)生葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶[10]，在生產(chǎn)過程中屬于較易被處理部分；半纖維素則是由除了葡萄糖以外還有木糖、半乳糖、甘露糖等成分構(gòu)成[6]，其中以木糖的水解較為復(fù)雜，需要經(jīng)過兩次或兩次以上的水解才可將大分子糖類轉(zhuǎn)化為小分子的葡萄糖等物質(zhì)，屬于較難被降解有機(jī)物質(zhì)；而木質(zhì)素結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，一般則認(rèn)為木質(zhì)素主要苯丙烷單元通過醚鍵和C-C鍵連接而成的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子芳香族化合物，難以被降解處理[11]。本次試驗(yàn)使玉米秸稈在經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理后其纖維素降解率達(dá)到52.94%，半纖維素降解率達(dá)33.33%，而難以被降解的木質(zhì)素其降解率也可達(dá)到2.67%(圖3)，這說明經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈產(chǎn)生了能夠促進(jìn)纖維素、半纖維素與木質(zhì)素水解的酶，在將大分子有機(jī)物水解的同時(shí)，也保障了后期厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣效率。

圖3 復(fù)合微生物菌劑預(yù)處理玉米秸稈纖維素、半纖維素與木質(zhì)素含量的變化

2.2 復(fù)合微生物菌劑預(yù)處理玉米秸稈對厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣的影響

2.2.1 產(chǎn)氣量的影響

由于空白對照組在厭氧產(chǎn)氣發(fā)酵試驗(yàn)階段發(fā)酵原料能夠正常維持厭氧發(fā)酵所需的有機(jī)物質(zhì)，且有合適的碳氮比與發(fā)酵溫度，故而能使空白對照組正常產(chǎn)氣并且可作為經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理組的產(chǎn)氣對照組。本次試驗(yàn)設(shè)定發(fā)酵周期為35 d，經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理后的玉米秸稈其產(chǎn)氣能力與未經(jīng)處理的空白對照組之間的產(chǎn)氣能力有很大的差異，通過測定其開始產(chǎn)氣時(shí)間、進(jìn)入產(chǎn)氣高峰時(shí)間和維持產(chǎn)氣高峰期的時(shí)間發(fā)現(xiàn)經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理后的玉米秸稈在第1 d已經(jīng)開始有產(chǎn)氣，較空白對照組提前了2 d，此外，經(jīng)過微生物處理組在第13 d開始進(jìn)入產(chǎn)氣高峰期，且維持時(shí)間長，進(jìn)入產(chǎn)氣高峰天數(shù)達(dá)14 d；相比而言，空白對照組則是在第17 d開始進(jìn)入產(chǎn)氣高峰且維持時(shí)間短，僅維持6 d(圖4)。這一現(xiàn)象則說明，經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈對提前產(chǎn)氣與增長產(chǎn)氣高峰時(shí)間上都有良好的促進(jìn)作用，進(jìn)而提高玉米秸稈能源化的轉(zhuǎn)化。

圖4 厭氧發(fā)酵日產(chǎn)氣量

2.2.2 累積產(chǎn)氣量的影響

兩組試驗(yàn)在經(jīng)過35 d厭氧產(chǎn)氣發(fā)酵后的累積產(chǎn)氣量如圖5所示。

圖5 厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量

經(jīng)過35 d的厭氧發(fā)酵，微生物預(yù)處理后的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量可達(dá)7 170 mL，而空白對照組的累積產(chǎn)氣量則為5 006 mL，兩組試驗(yàn)累積產(chǎn)氣量的差異極顯著(P<0.01)，綜合比較，經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在經(jīng)過厭氧產(chǎn)氣發(fā)酵后的累積產(chǎn)氣量要比空白對照組的高30.18%，效果明顯，說明復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理玉米秸稈對厭氧發(fā)酵的高效運(yùn)行有明顯的促進(jìn)作用。

2.2.3 甲烷含量的影響

本次的兩組試驗(yàn)在每次測定產(chǎn)氣量的同時(shí)，測定其甲烷的體積分?jǐn)?shù)，經(jīng)過35 d 的厭氧產(chǎn)氣發(fā)酵，兩組試驗(yàn)的甲烷體積分?jǐn)?shù)的變化如圖6所示，經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在厭氧產(chǎn)氣第11 d時(shí)，其甲烷體積分?jǐn)?shù)為37.765 4%，已經(jīng)接近40%，并且甲烷體積分?jǐn)?shù)超過40%的天數(shù)能夠維持到第29 d，且甲烷體積分?jǐn)?shù)最高還可達(dá)到77.096 43%，這說明在此段反應(yīng)時(shí)間有足夠的厭氧反應(yīng)所需的有機(jī)物質(zhì)來供給厭氧發(fā)酵，維持厭氧反應(yīng)過程的高效運(yùn)行，相比來看，空白對照組則在反應(yīng)開始后的第15 d時(shí)，甲烷的體積分?jǐn)?shù)才達(dá)到40%以上，并且甲烷體積分?jǐn)?shù)維持在40%以上的天數(shù)僅有10 d，經(jīng)過兩組試驗(yàn)對比來看，可以說明經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵過程中對于甲烷的轉(zhuǎn)化率高。

圖6 厭氧發(fā)酵甲烷含量

3 討論

我國秸稈資源豐富，其中玉米秸稈中含有豐富的有機(jī)物質(zhì)，其主要由碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪，纖維素、半纖維素與木質(zhì)素約組成[2]，但由于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素難以被直接的水解，若不經(jīng)過預(yù)處理直接進(jìn)行厭氧發(fā)酵處理其有機(jī)物質(zhì)應(yīng)用效率較低，故而將采取預(yù)處理措施，增加纖維素、半纖維素與木質(zhì)素的水解，進(jìn)而對后續(xù)厭氧發(fā)酵起到促進(jìn)作用[12]。

1)揉搓曝氣預(yù)處理與微生物預(yù)處理相結(jié)合可有效破壞纖維素、半纖維素與木質(zhì)素，加快水解。常娟等[13]對玉米秸稈采用蒸汽爆破的方法，然后再進(jìn)行單一米曲霉的預(yù)處理試驗(yàn)中，將進(jìn)過蒸汽爆破處理后的玉米秸稈與米曲霉混合預(yù)處理6 d后，其纖維素與半纖維素的降解率可達(dá)27.89%和64.80%，而只進(jìn)行爆破處理的玉米秸稈其纖維素的降解率只有8.47%。而高贊等[14]利用黑曲霉、綠色木霉等混合后的復(fù)合菌對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理研究試驗(yàn)中，經(jīng)過15 d的預(yù)處理周期，玉米秸稈中的纖維素、半纖維素的降解率可達(dá)48.53%、36.38%。本文研究采用將玉米秸稈揉搓曝氣預(yù)處理與復(fù)合微生物菌劑CM-2相結(jié)合，經(jīng)過30 d預(yù)處理周期，與直接經(jīng)過揉搓曝氣預(yù)處理后的玉米秸稈相比，纖維素半纖維素的降解率可達(dá)52.94%和33.33%，并且木質(zhì)素的降解率也有2.67%。由此可知，經(jīng)過揉搓曝氣與復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理后的玉米秸稈可以有效提高玉米秸稈中纖維素與半纖維素的水解。

2)玉米秸稈中的有機(jī)物質(zhì)在經(jīng)過預(yù)處理后能夠更好的在厭氧發(fā)酵過程中被應(yīng)用，黃文博等[15]利用白腐菌對玉米秸稈進(jìn)行前期預(yù)處理以提高沼氣產(chǎn)氣量研究中，經(jīng)過白腐菌處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵試驗(yàn)中的累積產(chǎn)氣量較未經(jīng)白腐菌處理的空白對照組提高了12.32%；趙肖玲等[16]利用黑曲霉與木霉復(fù)合菌劑處理秸稈提高產(chǎn)甲烷性能研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過微生物處理后的玉米秸稈在進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)其累積產(chǎn)氣量較未經(jīng)微生物處理的對照組提高了10.06%；黃開明[17]等人利用黑曲霉、木霉、草酸青霉和白腐菌對玉米秸稈進(jìn)行前期預(yù)處理以提高產(chǎn)氣性能研究中，經(jīng)過復(fù)合微生物預(yù)處理后的玉米秸稈其累積產(chǎn)氣量比未經(jīng)復(fù)合微生物預(yù)處理的對照組提高了27.4%，并且在第4 d時(shí)，甲烷含量達(dá)到40%以上。本文試驗(yàn)表明，在經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈在厭氧產(chǎn)氣發(fā)酵試驗(yàn)中累積產(chǎn)氣量有明顯提升，經(jīng)過35 d的厭氧發(fā)酵，累積產(chǎn)氣量提高了30.18%。因此經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑處理后的玉米秸稈在水解纖維素半纖維素與木質(zhì)素的同時(shí)，在適當(dāng)?shù)膮捬醢l(fā)酵環(huán)境中可以獲得較高的甲烷產(chǎn)氣量，從而提高玉米秸稈資源的利用。

4 結(jié)論

本次試驗(yàn)利用復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理玉米秸稈，可使玉米秸稈的纖維素降解52.94%、半纖維素降解33.33%、木質(zhì)素降解2.67%，對經(jīng)過復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理后的玉米秸稈與牛糞按照1∶2的比例，在35 ℃條件下進(jìn)行35 d的厭氧產(chǎn)氣發(fā)酵其累積產(chǎn)氣量提高30.18%，并且采用復(fù)合微生物菌劑CM-2處理后的玉米秸稈其產(chǎn)氣效率有明顯的增加并且產(chǎn)氣高峰期時(shí)間可延長至14 d且在產(chǎn)氣高峰時(shí)的甲烷轉(zhuǎn)化率也提高了12.87%。

綜上所述，利用復(fù)合微生物菌劑CM-2處理玉米秸稈在降解纖維素、半纖維素與木質(zhì)素的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了在中低溫條件下，厭氧產(chǎn)氣效率的提高，增加了玉米秸稈中的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷的能力，為秸稈資源能源化的推進(jìn)提供了良好的解決方法。此外，本次研究所采用的厭氧發(fā)酵濃度可達(dá)15%，屬于干法發(fā)酵，此種方式更適于應(yīng)用在北方寒冷地區(qū)，對北方寒冷地區(qū)沼氣工程的推進(jìn)起到一定的促進(jìn)作用，并且還為玉米秸稈在預(yù)處理方式上提供了新的高效處理方法。