循環(huán)腫瘤細胞的分離與鑒定研究進展*

張 偎 綜述，徐克前 審校

1.中南大學湘雅醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，湖南長沙 410013；2.中南大學湘雅三醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410013

高效分離和準確鑒定循環(huán)腫瘤細胞(CTC)對腫瘤的早期診斷具有重要意義。目前，CTC的分離方法按原理可以分為物理分離和免疫分離兩大類，且各自分為許多亞類。分離后的細胞通常需要進一步鑒定分析，這是因為單純依靠分離方法捕獲的細胞純度較低，混雜了許多白細胞。通過對細胞表面分子標記、內(nèi)部核酸等進行定性、定量分析，不僅能夠得到高純度的CTC，還可以根據(jù)細胞分型的結(jié)果鑒別不同來源的腫瘤，為腫瘤的轉(zhuǎn)移、用藥和監(jiān)測提供可靠的幫助?，F(xiàn)對CTC的分離和鑒定方法進行綜述。

1 CTC的分離

1.1物理分離方法 物理分離方法也稱為“無標簽分離”，目前主要有密度梯度離心法、基于細胞大小分離法，以及與電學、聲學、光學分離相結(jié)合的微流控技術(shù)。

1.1.1密度梯度離心法 CTC核質(zhì)比較高，根據(jù)沉降系數(shù)的差異可將CTC分離開。目前開發(fā)出的平臺主要有Ficoll-Hypaque、Percoll和OncoQuick。Ficoll-Hypaque分離范圍較窄，多用于分離外周血單個核細胞，而Percoll利用不同濃度的離心劑，大大拓寬了分離范圍。帶有多孔篩的OncoQuick有效減少了白細胞污染[1]。密度梯度離心法操作簡單、成本低，但分離純度低，一般作為預富集方法。

1.1.2基于細胞大小分離法 CTC與血細胞相比體積通常較大，根據(jù)此差異可分離細胞。ISET、ScreenCell、Parylene-C、FMSA、CellSieve、3D鈀濾光片、鎳微孔篩等平臺均為微孔過濾裝置，平臺間的差異主要體現(xiàn)在濾膜材料、孔徑大小上，各類微孔濾膜的比較見表1。這些平臺分離出的細胞可以幫助監(jiān)測疾病的進展。如通過CellSieve微濾器分離結(jié)直腸癌切除術(shù)后患者肺靜脈血液中的CTC，可及早發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的肺部轉(zhuǎn)移[2]；通過分析CellSieve膜上捕獲的細胞，發(fā)現(xiàn)循環(huán)癌基質(zhì)細胞和CTC的區(qū)別及兩者與腫瘤進展的相關性[3]。微孔濾膜法捕獲效率高，但體積較小,有變形性的CTC可能被漏檢。

新發(fā)展的鐵流體動力學細胞分離(FCS)并不像大多數(shù)傳統(tǒng)方法一樣在膜上進行，而是利用生物相容性的鐵磁流體，對不同大小的細胞進行分離[4]。在癌細胞加標率約為每毫升100個的情況下，對肺癌、乳腺癌、前列腺癌來源的多種癌細胞系進行富集分離，平均捕獲率達92.9%[5]。FCS具有較高的生物相容性，細胞活力不受影響，但該方法仍無法從癌癥患者的血液中富集低濃度的CTC。

表1 各類微孔濾膜的比較

1.1.3微流控技術(shù) 微流控技術(shù)利用細胞慣性差異來分離細胞，不同質(zhì)量的細胞在流動過程中產(chǎn)生不同的方向和速度。質(zhì)量較大的CTC主要受慣性升力作用向內(nèi)壁移動，而質(zhì)量較小的血細胞主要受迪安流影響向外壁遷移。為提高分離效果，通道可設計成不同的形狀。如Vortex通道設計為直線形，ClearCell FX通道設計為對細胞活性更友好的螺旋形，而CTC-ΔChip平臺采用出口逐漸加寬的楔形設計，有效解決了出口堵塞問題。EDD 等[6]還報道了一種可用于分離CTC簇的微流體通道，該裝置以30 mL/h的速度將CTC簇捕獲在載玻片大小的裝置上。

微流控技術(shù)近幾年來發(fā)展迅速的一個重要原因是它可以與許多分離方法聯(lián)合使用，如電場分離、聲場分離、光學分離，在實現(xiàn)快速分離的同時有效保留細胞生物活性。ApoStream和LIFF是與電場分離相結(jié)合的微流控裝置，細胞介電特性的差異使CTC向帶有電極的方向移動，而血細胞被排斥流向洗脫液[7]。LIFF在原有的基礎上增加了電極數(shù)目，提高了分離速度[8]。Acoustic Chip是與聲學分離相結(jié)合的微流體裝置，產(chǎn)生駐波的壓電轉(zhuǎn)換器是設備的關鍵組件，不同體積和密度的細胞在聲場中產(chǎn)生不同的壓力節(jié)點而被分離[9]。光學分離根據(jù)折射率差異提示細胞間的差異，如流式細胞儀的前向散射光可反映細胞體積大小，側(cè)向散射光可反映細胞內(nèi)容物、核含量等信息，但該方法分離的細胞群常有交叉，需要質(zhì)控和定期校正。

1.2免疫分離方法 免疫分離方法主要通過抗原抗體、適配體等免疫相關物質(zhì)之間的特異性結(jié)合達到分離的目的。

1.2.1磁場中分離 在磁性載體上包被特異性抗體或適配體，利用外加磁場的作用分離細胞，根據(jù)載體靶向細胞的不同，可分為正向和負向兩種富集策略。

基于正向富集建立的平臺有Cellsearch、MACs等，其中Cellsearch已被廣泛應用。但腫瘤在轉(zhuǎn)移過程中容易發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導致上皮細胞黏附因子(EpCAM)低表達甚至不表達，因此，其他分子標記也正被逐步應用到CTC的分離中。如在磁納米粒子上包被脂質(zhì)體和衍生物[10]及EpCAM和N-鈣黏附蛋白[11]或表皮生長因子受體(EGFR)[12]的雙抗體，有效提高了不同腫瘤CTC的捕獲效率。

正向富集法的另一個缺點在于分離過程中可能丟失分子標記，不利于后續(xù)鑒定分析和細胞培養(yǎng)，此時，負向富集法的優(yōu)勢得以顯現(xiàn)。負向富集法建立的平臺有Cyttel、EasySep、MagSweeper等。其中，Cyttel、EasySep以磁珠為載體，MagSweeper利用磁性棒作為載體以減少非特異吸附。雖然負向富集法可以有效解決漏檢的問題，但捕獲純度有待提高。

1.2.2流動相分離 流動相分離CTC可分別在體外和體內(nèi)進行。CTC的體外分離主要是通過微流控芯片來實現(xiàn)，捕獲的細胞可直接在芯片內(nèi)計數(shù)與鑒定，也可以通過洗脫收集細胞。出現(xiàn)早且應用廣的平臺有CTC-Chip、HB-Chip、CTC-iChip和Nanovelcro芯片等。CTC-Chip易造成樣品堵塞；HB-Chip由于采用了透明材料，可用于高分辨率成像；由兩個模塊構(gòu)成的CTC-iChip有較高的捕獲純度效率；Nanovelcro芯片以納米纖維為捕獲基質(zhì)，極大提高了捕獲效率。有報道利用激光顯微切割系統(tǒng)分離Nanovelcro芯片捕獲的單個CTC，發(fā)現(xiàn)肺腺癌與間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排[13]和EGFR突變[14]有較強的相關性，可以有效監(jiān)測疾病進展和耐藥反應。

最近也出現(xiàn)了一些新的微流控檢測平臺，這里報道一種二維分選裝置，它對細胞表面標志物進行兩次分型，從而精細化地將細胞分選為不同亞群，可以有效評估腫瘤的轉(zhuǎn)移、惡化[15]。由于分離過程中的血細胞干擾是較大的影響因素，LI等[16]制造了紅細胞膜模擬表面的捕獲基質(zhì)以吸附血細胞，并利用靶向配體的連接實現(xiàn)Hela細胞的高捕獲率(91%)和高純度(89%)。

高科技的發(fā)展也推動了體內(nèi)分離技術(shù)的進步，但目前出現(xiàn)的裝置并不多，主要是CellCollector和微型電機。CellCollector是涂覆有EpCAM抗體的醫(yī)用不銹鋼絲，將鋼絲置于靜脈血管內(nèi)30 min即可捕獲CTC[17]。微型電機以腫瘤患者體內(nèi)的H2O2作為推進能源，電機表面涂覆抗體快速定位靶細胞[18]。體內(nèi)富集方法無需采血，保證了充足的樣本來源，但影響因素多，如存在高脂血癥、黃疸等導致的非特異吸附問題，其安全性也還需進一步驗證。

2 CTC的鑒定

目前，鑒定CTC的方法主要有免疫熒光染色法、核酸分析法、光譜分析法及蛋白質(zhì)分析法。

2.1免疫熒光染色法 免疫熒光染色法利用熒光素標記對細胞進行鑒定，常用的細胞標記有核染色(DAPI、Hoechst)、上皮細胞表面抗原(CKs)、間充質(zhì)蛋白和白細胞分化抗原(CD)等。許多新的標志物也不斷被學者應用到腫瘤的研究中，以往的研究發(fā)現(xiàn)高表達CD44、CD47的腫瘤細胞有更強的遷移和侵襲能力，這些細胞標志物可以幫助患者選擇用藥以提供精準的治療方案，如GUIBERT等[19]檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織和細胞的程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)水平，以篩選可用于免疫檢查點抑制劑治療的患者，熒光顯微鏡、自動化圖像識別設備和多參數(shù)的流式細胞分選系統(tǒng)可以用來觀測熒光染色結(jié)果。熒光顯微鏡適用于樣本量較小的研究，CellSearch即是通過此種方法鑒定CTC，但存在人工鏡檢造成的主觀偏倚。自動化圖像識別設備克服了上述缺點，捕獲的細胞經(jīng)光纖陣列掃描后，傳感器將圖像呈遞給軟件進行處理，常應用于芯片、膜等固體化捕獲裝置的成像分析，但該方法要求固相載體保持一定清潔度，且細胞為單層排列。多參數(shù)流式細胞分選系統(tǒng)使用多種細胞表面標記，在鑒定細胞表型的同時可以高效分選細胞，SEN等[20]利用流式分選系統(tǒng)實現(xiàn)了多種腫瘤細胞系的分離。

2.2核酸分析法 檢測細胞內(nèi)部核酸的核酸分析法主要以分子雜交、PCR和基因測序為代表。

分子雜交法利用生物探針與細胞核酸雜交可對細胞定性、定位。Canpatrol通過與捕獲細胞的mRNA分子雜交，檢測準確度達80%。最近報道的一種TPN生物探針，能夠滲透進入活細胞與線粒體特異結(jié)合，根據(jù)線粒體的發(fā)光差異來區(qū)分腫瘤細胞和血細胞[21]。這種探針對細胞活力和完整性影響很小，可以作為鑒定CTC的新工具。

OncoCEE和AdnaTest應用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過檢測多種乳腺癌相關基因來評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。除了鑒定細胞系別，PCR技術(shù)還可以用于建立腫瘤模型。有研究表明，從不同細胞系中分離出的EpCAM(+)和HER2(+)亞群用于建立更接近原位的3D乳腺癌腫瘤模型，可以更準確地評估新的治療策略和藥物[22]。ZHAO等[23]通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)CTC-3細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干性標志物的水平較MCF-7細胞更高，提示CTC-3細胞是研究乳腺癌惡性行為的更好模型。近年來，液滴/微孔PCR發(fā)展迅速，并可對多種遺傳信息如CRISPR/Cas9改進的KRAS突變、乳腺癌PIK3CA熱點突變進行快速、可靠、準確的定量檢測，該技術(shù)有廣闊的發(fā)展前景，未來有望逐步取代傳統(tǒng)的PCR。

基因測序目前應用最廣泛的是單細胞測序。XU等[24]對早期肺癌患者外周血中單個CTC進行外顯子DNA測序，檢測到包括細胞侵襲、DNA修復等相關基因的突變，有利于進一步探索腫瘤的異質(zhì)性信息。單細胞測序還能通過拷貝數(shù)變異檢測存在異常的基因組，通過在數(shù)據(jù)庫中進行比對，從而在分子水平上分析單個細胞。

核酸分析法的關鍵在于檢測的基因與所研究疾病要有較強的關聯(lián)程度，與免疫熒光法相比，它可以提供客觀、可量化的結(jié)果，但需要裂解細胞，難以提供形態(tài)學方面的數(shù)據(jù)。

2.3光譜分析法 光譜分析技術(shù)廣泛應用于生物化學領域，如今也有用于鑒定CTC的報道，主要是微核磁共振檢測技術(shù)和拉曼檢測技術(shù)。

與磁場分離有異曲同工之處，微核磁共振檢測系統(tǒng)中包被抗體的磁納米顆粒與細胞結(jié)合后經(jīng)磁響應而被分離，但后者產(chǎn)生的核磁共振信號起到了微小放大的作用，有效提高了檢測靈敏度,研究表明對大腸癌有較好的診斷價值[25]。拉曼檢測技術(shù)利用包被特異性抗體的活性納米探針與細胞結(jié)合，根據(jù)不同類型細胞特征譜線的差異鑒定CTC，這些納米探針由不同的拉曼報告分子(主要是有機化學物質(zhì))和納米顆粒構(gòu)成，如CHO等[26]利用金納米顆粒構(gòu)成的活性探針鑒定出了乳腺癌的5種亞型。拉曼檢測技術(shù)還可以無損傷地對細胞內(nèi)部核酸進行分析，具有高靈敏度、高分辨率的特點，但目前主要用于檢測循環(huán)游離DNA和DNA損傷修復，相信未來在CTC鑒定方面有進一步的發(fā)展。

2.4蛋白質(zhì)分析法 蛋白質(zhì)分析法在基因翻譯水平通過檢測蛋白質(zhì)水平來鑒定CTC，電泳技術(shù)、Northern雜交是常見的檢測手段，這里介紹的蛋白質(zhì)芯片/微陣列即是基于以上技術(shù)原理而開發(fā)的。ProteinSimple公司研發(fā)的Milo是第一個可用于CTC鑒定的蛋白質(zhì)芯片，由1 000～2 000個用于容納單細胞的微孔構(gòu)成，細胞被裂解后電泳，并加入多種熒光抗體標記同時檢測數(shù)十種靶蛋白，與傳統(tǒng)檢測方法相比，可以進行單個細胞水平的鑒定分析。除此之外，通過檢測一系列代謝基因編碼的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分析法可以發(fā)現(xiàn)CTC高表達的基因，探索腫瘤與代謝基因的關系，并提示腫瘤的惡性變化。CHEN等[27]利用蛋白微陣列檢測前列腺癌患者的腫瘤細胞，確定磷酸甘油酸激酶(PGK1)和葡萄糖六磷酸脫氫酶(G6PD)可以作為CTC的最佳代謝標志物，且患者體內(nèi)PGK1和G6PD水平與前列腺癌轉(zhuǎn)移程度呈正相關。但由于不同核酸的基因表達產(chǎn)物可能相似或一致，檢測靶蛋白前，需要確定涉及的相關基因的表達產(chǎn)物是否有交叉，否則無法得到真實可靠的結(jié)論。目前已經(jīng)發(fā)展起來的CTC鑒定方法見表2。

表2 CTC的鑒定方法

3 總結(jié)與展望

美國食品藥品管理局(FDA)將CTC正式批準為癌癥進展監(jiān)測中新的生物標志物，它的分離、鑒定對于腫瘤早期診斷、病情監(jiān)測十分重要，因此，發(fā)展了許多技術(shù)方法。物理分離方法無需抗體標記或染色，可以較好地保留細胞的完整性和生物學活性，有利于后續(xù)細胞培養(yǎng)；而免疫學分離方法可能造成細胞抗原的丟失、改變。這些分離富集的方法推動了腫瘤疾病中整個基因組的研究，因此，需要通過各種分子標記、核酸分析、光譜分析等方法對細胞分離、鑒定。目前，檢測CTC仍處于臨床前階段，限制其臨床應用的主要因素是缺乏可靠的臨界值，以及用于分離、鑒定CTC的工具尚未成熟，還需要進行大量的臨床試驗來提供有效的證據(jù)。未來，相信CTC的檢測平臺會向著分離、鑒定一體化、多種技術(shù)聯(lián)合應用的方向發(fā)展，并能夠以簡便快速、準確可靠、低成本、高通量的檢測優(yōu)勢服務于臨床與科研。