廣西黑衣壯兒童VDR基因rs1544410、rs7975232位點(diǎn)多態(tài)性研究

陸壯念，林娜，梁立婷，楊麗娟

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000)

維生素D受體(Vitamin D receptors，VDR)基因定位于人染色體12q13上，能夠編碼親核蛋白，從而介導(dǎo)1，25(OH)2D3在人體生理學(xué)過程中發(fā)揮生物效應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，VDR基因突變與遺傳學(xué)疾病的發(fā)生有關(guān)。VDR基因中單個堿基突變雖然不明確引起遺傳病，但在人群中有一定分布頻率成為單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)[3]。這種SNP多態(tài)性可穩(wěn)定遺傳，從而引起子代多種疾病發(fā)生發(fā)展。目前國內(nèi)外研究報道共有22個點(diǎn)突變能夠?qū)е耉DR基因功能的缺失[4-5]。rs1544410、rs7975232位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在不同地區(qū)、不同種族之間差異報道結(jié)論不一，而在廣西黑衣壯兒童中分布研究尚未見報道。本次研究通過選取115例廣西黑衣壯兒童為研究對象，分析其VDR基因rs1544410、rs7975232位點(diǎn)基因型和等位基因分布及特點(diǎn)，比較與其他地區(qū)不同種族人群差異情況，為后續(xù)研究VDR在不同地區(qū)種族人群中與各種疾病相關(guān)性和致病因素研究提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年5月—2019年5月在我院兒童保健康復(fù)科體檢健康兒童為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<14歲；②臨床指標(biāo)、發(fā)育指標(biāo)正常；③兒童祖輩三代均為廣西黑衣壯；④兒童本人和(或)監(jiān)護(hù)人知情同意并自愿參與研究。最后納入115名，男童66名，女童49名，年齡3～12歲。本次研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采取所有研究對象外周靜脈血2 ml，置于EDTA抗凝管中，3500 r/min，15 min離心取上層血清。采用離心柱型血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，操作步驟詳見說明書，置入-80℃保存待測。

1.2.2 引物設(shè)計 通過primer3在線軟件(http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計引物，委托捷瑞生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增rs1544410 位點(diǎn)和rs7975232位點(diǎn)的引物見表1。

表1 rs1544410位點(diǎn)和rs7975232位點(diǎn)引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 采用15 μl反應(yīng)體系，其中包括2.0 μl模板 DNA，10×Buffer1.5 μl 、Mg2+1.5 μl 、1 UTaq 酶、0.3 μl dNTP、1 μl多重PCR引物，剩余的體積用雙蒸水補(bǔ)足至15 μl ，充分混勻，離心，置入八連管中。PCR反應(yīng)采用東勝龍黑金剛 EDC-810 PCR 儀，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min；擴(kuò)增程序：95℃ ×3 min，94℃×15 s，55℃×15 s，72℃ ×30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸 3 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化 PCR擴(kuò)增后取3 μl產(chǎn)物用0.2 μl ExoI(Fermentas公司)和0.8 μl Fer-mentas公司生產(chǎn)的FastAP純化。

1.2.5 延伸反應(yīng) 延伸反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物2 μl ，SNaPshot Multiplex kit 1 μl ，延伸引物1 μl ，水補(bǔ)至6 μl 。延伸反應(yīng)程序：96℃ ×1 min；96℃ ×10 s，52℃×5 s，共30個循環(huán)60℃×30 s。

1.2.6 SNP分析 取1 μl加入10 μl buffer，95℃變性 3 min，立即冰水浴，上測序儀(ABI3730xl)。SNP分型用 GeneMapper 4.1軟件分析。

1.3 其他民族、地區(qū)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)獲取 通過在線Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)獲取千人基因組計劃VDR基因位點(diǎn)rs1544410、rs7975232在其他民族、地區(qū)基因多態(tài)性分布數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，用計數(shù)法直接計算基因型和等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)群體代表性，基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法作比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α =0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡和基因型分布 VDR基因位點(diǎn)rs1544410、rs7975232基因分型經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析，兩位點(diǎn)基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，所選人群均具有群體代表性(P>0.05)，結(jié)果具有代表性。rs1544410位點(diǎn)存在CC 、CT兩種基因型，基因型峰型見圖1。rs7975232位點(diǎn)存在CC 、AA 、AC三種基因型，基因型峰型見圖2。

注：A為CC基因型峰型；B為CT基因型峰型。

注：A為AA基因型峰型；B為AC基因型峰型；C為CC基因型峰型。

2.2 VDR基因rs1544410、rs7975232 SNP分布 廣西黑衣壯兒童人群VDR 基因rs1544410基因型CC和CT、等位基因C和T在男童和女童中分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。rs7975232基因型CC、AC、AA和等位基因A、C在男童和女童中分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 VDR基因rs1544410位點(diǎn)多態(tài)性在廣西黑衣壯兒童中的比較

表3 VDR基因rs7975232位點(diǎn)多態(tài)性在廣西黑衣壯兒童中的比較

2.3 VDR基因rs1544410、rs7975232不同地區(qū)、民族間比較 經(jīng)過比較分析，廣西黑衣壯兒童rs1544410基因型分布、等位基因頻率與1000 Genomes Project的JPT、YRI、GIH、IBS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。廣西黑衣壯兒童rs7975232與1000 Genomes Project的YRI、GIH、IBS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

3 討論

VDR是類固醇急速受體和甲狀腺激素受體超家族和能源之一，本質(zhì)上是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子[6]。維生素D的絕大多數(shù)生物學(xué)功能是通過VDR介導(dǎo)從而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄過程而實(shí)現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)

表4 VDR基因rs1544410位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率與各種族人群中的比較

表5 VDR基因rs7975232位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率與各種族人群中的比較

和基因組學(xué)的發(fā)展，學(xué)者發(fā)現(xiàn)VDR上存在多個SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。而遺傳可能與環(huán)境因素相互作用，從而導(dǎo)致疾病在不同人群中發(fā)生率有差異。VDR基因位于人類常染色體12q13上，由8個編碼外顯子和6個非編碼外顯子交替剪接而成，約75個堿基[5]。VDR廣泛分布于人體內(nèi)組織細(xì)胞中，除了分布在腸道、腎臟和骨骼等靶器官外，在血液系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和多種免疫細(xì)胞膜中也有分布[7]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，VDR的SNP與慢性腎臟病[8]、糖尿病[9]、支氣管哮喘[10]、自身免疫性疾病[11]、結(jié)核病[12]、腫瘤[13]和高血壓[14]等多種疾病有關(guān)。Zhao DD 等[15]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，亞洲兒童哮喘中ApaI基因(rs7975232)SNP起到特殊作用，但BsmI(rs1544410)基因SNP對兒童哮喘易感性的影響卻很小。Li J等[16]研究發(fā)現(xiàn)，VDR基因的7579232位點(diǎn)可能與中國漢族人群的系統(tǒng)性硬化癥患者的發(fā)病有關(guān)，且ApaI基因型頻率的優(yōu)勢模型可能與紅細(xì)胞沉降率風(fēng)險增加有關(guān)。Al-Ghafari AB等[17]在沙特人中研究發(fā)現(xiàn)，VDR SNPs rs7975232的SNP增加直腸癌的發(fā)生風(fēng)險，而rs1544410 SNP降低了直腸癌的發(fā)生風(fēng)險，提示ApaI和TaqI SNP可能被用作沙特人直腸癌的診斷生物標(biāo)志物。Pepineli AC等[18]研究發(fā)現(xiàn)，VDR的SNP與麻風(fēng)病的發(fā)生有關(guān)，但rs1544410、rs975232位點(diǎn)SNP形成的單倍型與麻風(fēng)病本身和多細(xì)菌臨床形式有關(guān)。以上研究均證明，同一基因位點(diǎn)在不同地區(qū)人群中可能導(dǎo)致不同疾病的發(fā)生風(fēng)險不同。因此為了了解不同地區(qū)、不同民族或種族VDR基因多態(tài)性的分布和表達(dá)差異，為SNP在疾病的基因診斷、個體化治療實(shí)施中應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

壯族是我國人數(shù)最多的少數(shù)民族，集中分布在廣西壯族自治區(qū)。黑衣壯是壯族中一個重要的支系，聚居于西南邊陲廣西那坡縣境內(nèi)[19]。本次研究中發(fā)現(xiàn)，廣西黑衣壯兒童中VDR基因rs1544410中CC、CT基因型占比分別為87.83%、12.17%，等位基因C為93.91%。rs7975232中基因型CC、AC基因型占比為48.70%、43.48%，等位基因C為70.43%。兩個SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在不同性別兒童中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示性別對VDR基因SNP分別影響不明顯，在分析VDR兩個SNP位點(diǎn)與其他疾病相關(guān)性時可以不考慮性別對基因分布的影響。此外，我們還與千人基因組計劃(1000 Genomes Project)研究的結(jié)果進(jìn)行比較。千人基因組計劃是由中美英等多國科研機(jī)構(gòu)聯(lián)合發(fā)起的，包括歐洲、美洲、亞洲、非洲的14個國家和地區(qū)不同人群中2500人的基因數(shù)據(jù)，是科學(xué)界首次千人規(guī)模以上基因組的比較，通過發(fā)現(xiàn)一些罕見的基因變異，分析與疾病的相關(guān)性，為指導(dǎo)預(yù)防、治療相關(guān)疾病提供參考。本次研究中與千人基因計劃中JPT、YRI、GIH、IBS中VDR基因rs1544410和rs7975232基因型和等位基因頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西黑衣壯兒童rs1544410、rs79752325與其他地區(qū)人群相比，基因分布和等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ，提示在分析VDR兩個SNP位點(diǎn)與其他疾病相關(guān)性時要考慮地區(qū)和民族或種族的差異。而這些差異的形成可能是基因和不同地區(qū)環(huán)境聯(lián)合作用導(dǎo)致[20]，可能與生活環(huán)境、氣候變化、飲食等因素有關(guān)[21]。

本次研究對廣西黑衣壯兒童VDR基因在分析VDR兩個SNP位點(diǎn)與其他疾病相關(guān)性時位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布及特點(diǎn)進(jìn)行首次報道，為VDR基因的SNP與廣西兒童疾病相關(guān)性研究提供信息，同時也有助于研究地區(qū)性疾病的致病因素以及發(fā)生發(fā)展的深入研究。但本次研究也存在一定的不足之處。首先，研究的樣本量小，樣本來源單一，可能存在選擇偏倚；第二，三代以內(nèi)黑衣壯信息由研究對象提供，其真實(shí)性無法判斷，可能影響結(jié)果的可靠性；第三，研究結(jié)果具有區(qū)域代表性，在外推應(yīng)用上可行性局限。這些都有待我們后續(xù)擴(kuò)大樣本量、進(jìn)一步深入研究解決。

綜上所述，廣西黑衣壯兒童VDR基因rs1544410，rs7975232位點(diǎn)SNP具有地域性，可為當(dāng)?shù)豓DR基因相關(guān)疾病的預(yù)防和診療研究提供科學(xué)理論依據(jù)。