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    乳源β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠的抗衰老作用研究

    2021-05-12 14:07:34王珊珊鞠曉云范乃兵卞勇閆靜杰
    中國乳品工業(yè) 2021年4期
    關鍵詞:灌胃腦組織腎臟

    王珊珊,鞠曉云,范乃兵,卞勇,閆靜杰

    (1.南京中醫(yī)藥大學,南京 210023;2.南京郵電大學,南京 210095)

    0 引 言

    自然衰老是所有生物體自發(fā)的、必經(jīng)的復雜過程,自然衰老導致的人口老齡化問題已成為全球性問題,世界上絕大多數(shù)國家的老齡化問題越來越明顯[1-2]。老齡化導致慢性疾病發(fā)病率增加的問題使得衰老研究成為生命科學領域的重大問題。目前,國內(nèi)外學者提出多種關于機體衰老學說,但是最具代表性的是Harman在1956年提出的自由基學說[3-4]。該學說認為,機體內(nèi)抗氧化酶類活性會隨著年齡的增長而下降,導致機體清除自由基的能力下降,從而導致機體內(nèi)自由基堆積;過量的自由基引起細胞代謝紊亂以致機體多器官、多系統(tǒng)功能減退,進而導致疾病和衰老[5-6]。因此,提高體內(nèi)抗氧化酶類活性,清除過量的自由基已成為抗衰老研究的核心,而天然抗氧化劑以其安全、高效、無副作用等特點,正引起廣大學者的關注。

    β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7,β-CM-7)是1979年Brantl等[7]在牛乳的酪蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)的小分子肽,其結構為Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile。β-酪啡肽-7能以完整肽段的形式被吸收,且不會引起機體的免疫排斥反應,加之其食物源的安全性,已越來越多地引起人們的重視[8]?,F(xiàn)有的研究表明β-酪啡肽-7不僅可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血糖、保護腎損傷等功能,還可以提高動物機體的抗氧化功能[9-10]。但是β-酪啡肽-7對自然衰老個體抗氧化應激是否有效果,特別是對自然衰老個體器官是否產(chǎn)生影響,目前相關研究甚少。本實驗以自然衰老小鼠作為研究對象,通過測定自然衰老小鼠臟器指數(shù)、血清以及心臟、肝臟、腎臟和腦中的 SOD、MDA、MAO及GSH-Px含量,觀察β-酪啡肽-7對老年小鼠的影響,以期為β-酪啡肽-7的開發(fā)利用奠定基礎。

    1 材 料

    1.1 試劑

    β-酪啡肽-7購自Sigma公司(配制成濃度為10μmol/L溶液,-20℃保存);超氧化物歧化酶(SOD)、單胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、蛋白定量測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

    1.2 主要儀器

    Polytron PT 1200CL手持式電動勻漿機,瑞士;Miklro-22R高速低溫離心機,德國Andreas Hettich GMBh8 CO.KG;Thermo FI-01620全波長酶標儀,美國;漩渦振蕩器,天津泰普公司;恒溫水浴鍋,上海榮華儀器公司;BS210S電子分析天平,北京賽多利斯天平有限公司。

    1.3 實驗動物

    SPF級雌雄各半C57小鼠60只,其中2月齡10只,16~18月齡40只,(北京維通利華提供,實驗動物生產(chǎn)許可證[號碼:SCXK(蘇)2001-0005]),實驗動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障設施(實驗動物使用許可證[號碼:SYXK(蘇)2018-0001])。

    2 方 法

    2.1 動物分組及處理

    適應性飼養(yǎng)1個星期后,將10只2月齡C57小鼠作為青年對照組;40只16~18月齡C57小鼠隨機分為:老年模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只;連續(xù)喂養(yǎng)60 d,每星期稱量體重,并注意觀察動物毛色、精神狀態(tài)、飲食、飲水、糞便等情況,具體處理方法如表1所示。

    表1 動物分組及處理

    2.2 樣品采集

    小鼠禁食24 h,眼眶采血,血液靜止30 min后,2 000 rpm離心20 min,吸取上清,-20℃保存?zhèn)溆?;采血后頸椎脫臼處死,取大腦、心臟、肝臟、腎臟等組織用生理鹽水漂洗并用濾紙吸干后稱其重量,液氮速凍后轉到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 臟器系數(shù)測定

    按文獻[11]方法計算小鼠的臟器系數(shù),臟器指數(shù)計算公式如下:

    臟器系數(shù)(%)=小鼠臟器濕重(g)/體重(g)×100

    2.4 組織勻漿液的制備

    稱取100 mg各組織放入1 mL裂解液中,冰上勻漿,12 000 rpm 4℃離心15 min,吸取上清液,棄去沉淀,二喹啉甲酸(Bicinchonininc Acid,BCA)法測定蛋白濃度,上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.5 指標的測定

    按試劑盒說明操作測定血清和心臟、肝臟、腎臟、大腦組織勻漿液的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、單胺氧化酶(MAO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)指標。

    2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,差異顯著性檢驗采用單因子方差分析(One way ANOVA,LSD)。所有數(shù)值以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

    3 結 果

    3.1 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

    如表2所示,與青年對照組相比,老年模型組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)均呈下降趨勢,其中心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腦指數(shù)顯著下降(P<0.05);低劑量組、中劑量組和高劑量組的各臟器指數(shù)均高于老年模型組,其中隨著β-酪啡肽-7灌胃劑量的提高,各臟器指數(shù)越接近青年對照組的臟器指數(shù),心臟指數(shù)、腦指數(shù)顯著高于模型老年組(P<0.05),肝臟指數(shù)極顯著高于老年模型組(P<0.01),提示灌胃β-酪啡肽-7組可能對改善自然衰老小鼠臟器指數(shù)有促進作用,并且隨著灌胃劑量的增加,改善效果越明顯。

    表2 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠臟器指數(shù)的影響(n=10)

    3.2 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織SOD的影響

    由圖1看出,β-酪啡肽處理組能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的SOD活性。與青年對照組相比,低劑量β-酪啡肽-7能夠升高自然衰老小鼠血清和各臟器的SOD活性,但差異不顯著(P>0.05);中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠肝臟中SOD活性(P<0.05),高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠血清和腦組織中的SOD活性(P<0.05),極顯著上調(diào)肝臟組織中的SOD活性(P<0.01);提示灌胃β-酪啡肽-7對SOD活性的提高有一定促進作用,并且隨著灌胃劑量的增加,促進作用越顯著。

    圖1 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中SOD活性比較(n=10)

    3.3 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織MDA的影響

    由圖2看出,老年模型組小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量與青年對照組相比,均呈升高趨勢,其中血清、心臟、腎臟顯著升高(P<0.05),肝臟和腦組織中MDA含量極顯著升高(P<0.01)。β-酪啡肽處理組能夠下調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量,低劑量β-酪啡肽-7能夠降低自然衰老小鼠血清和各臟器的MDA活性,但差異不顯著(P>0.05);中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MDA活性(P<0.05),高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MDA活性(P<0.05),極顯著降低肝臟和腦組織中的MDA活性(P<0.01);提示灌胃β-酪啡肽-7可降低自然衰老小鼠血清和各臟器中MDA的含量,并且隨著灌胃劑量的增加,降低作用越顯著。

    圖2 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中MDA活性比較(n=10)

    3.4 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織GSH-PX的影響

    由圖3可看出,與青年小鼠相比,自然衰老小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的GSH-Px活性降低。β-酪啡肽處理組能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的GSH-Px活性,其中中劑量和高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)血清和心臟組織中GSH-Px的活性(P<0.05);提示灌胃β-酪啡肽-7對GSH-Px活性的提高有一定促進作用,并且隨著灌胃劑量的增加,促進作用越顯著。

    圖3 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中GSH-Px活性比較(n=10)

    3.5 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織MAO的影響

    圖4 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中MAO活性比較(n=10)

    由圖4看出,老年模型組小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MAO含量與青年對照組相比,均呈升高趨勢,其中心臟、腎臟和腦組織中MAO顯著升高(P<0.05);血清和肝臟中MAO含量極顯著升高(P<0.01)。β-酪啡肽處理組能夠下調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MAO含量,低劑量β-酪啡肽-7能夠降低自然衰老小鼠血清和各臟器的MAO活性,但差異不顯著(P>0.05);中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MAO活性(P<0.05),高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MAO活性(P<0.05),極顯著降低肝臟和腦組織中的MDA活性(P<0.01);提示灌胃β-酪啡肽-7可降低自然衰老小鼠血清和各臟器中MAO的含量,并且隨著灌胃劑量的增加,降低作用越顯著。

    4 討 論

    機體受到代謝機能和神經(jīng)系統(tǒng)的共同調(diào)節(jié),心臟、肝臟、腎臟是重要的代謝器官;腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分,因此,臟器指數(shù)可反映實驗動物的健康狀況,可通過心臟、肝臟、腎臟和腦指數(shù)來判斷實驗動物的機能變化和衰老狀況[12-13]。本實驗研究表明,與青年對照組相比,老年模型組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)均呈下降趨勢,其中心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腦指數(shù)顯著下降(P<0.05),表明老年模型組動物處于自然衰老狀態(tài);低劑量組、中劑量組和高劑量組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)均高于老年模型組,其中隨著β-酪啡肽-7灌胃劑量的提高,各臟器指數(shù)越接近青年對照組的臟器指數(shù),心臟指數(shù)、腦指數(shù)顯著高于模型老年組(P<0.05),肝臟指數(shù)極顯著高于老年模型組(P<0.01),提示灌胃β-酪啡肽-7組對改善自然衰老小鼠臟器指數(shù)有促進作用,并且隨著灌胃劑量的增加,改善效果越顯著。

    超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是體內(nèi)清除自由基的關鍵酶,可以清除機體自由基,其活力可反映機體抗氧化的能力[14-15];已有研究證實,SOD能清除超氧負離子自由基,從而保護機體細胞和組織不受自由基的損害,延緩機體衰老[16]。本實驗研究表明,β-酪啡肽處理組能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的SOD活性;中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠肝臟中SOD活性(P<0.05),高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠血清和腦組織中的SOD活性(P<0.05),極顯著上調(diào)肝臟組織中的SOD活性(P<0.01),這與印虹等人[17]的研究結果一致;提示灌胃β-酪啡肽-7對SOD活性的提高有一定促進作用,并且隨著灌胃劑量的增加,β-酪啡肽-7抗氧化和抗衰老能力增強。

    丙二醛(malondialdehyde,MDA)是自由基攻擊生物體的降解產(chǎn)物,牛文民等人[18]研究表明MDA能夠影響細胞代謝、細胞結構的改變,并能促進細胞凋亡,抑制生物信息傳遞,因而測定MDA的量可反映組織和細胞損傷的程度。本研究表明,老年模型組小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量與青年對照組相比,均呈升高趨勢,提示老年模型組小鼠的組織和細胞處于損傷和衰老狀態(tài)。灌胃β-酪啡肽-7能夠下調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量;其中,中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MDA活性(P<0.05),高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MDA活性(P<0.05),極顯著降低肝臟和腦組織中的MDA活性(P<0.01);提示β-酪啡肽-7可減少自然衰老小鼠血清和各臟器中MDA的積累,降低MDA對機體的損傷作用。

    谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathi-one Peroxidase,GSH-Px)是一種重要的廣泛存在于機體內(nèi)的過氧化物分解酶,可以清除細胞代謝過程中產(chǎn)生的羥自由基和過氧化物,減輕細胞膜的過氧化作用[19]。另有研究表明,GSH-Px還能促進H2O2分解,從而使過氧化物無法對細胞膜造成損害,因而可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的GSH-Px活性,并且隨著灌胃劑量的增加,促進作用越顯著。

    單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是神經(jīng)遞質降解酶家族成員之一,主要存在于神經(jīng)膠質細胞內(nèi),在神經(jīng)系統(tǒng)中主要調(diào)節(jié)單胺類遞質的含量,其低活性有利于保持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能,對機體的抗氧化及抗衰老有促進作用[21-22],本實驗通過對自然衰老小鼠灌胃β-酪啡肽-7發(fā)現(xiàn),中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MAO活性(P<0.05),高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MAO活性(P<0.05),極顯著降低肝臟和腦組織中的MAO活性(P<0.01),說明β-酪啡肽-7能夠減少MAO的堆積,保護機體免受自由基損傷。

    綜上,自然衰老可導致機體SOD、GSH-Px活性降低,MDA、MAO含量增高,自由基堆積,導致衰老進程加速,從而引發(fā)一系列疾病。本實驗通過灌胃β-酪啡肽-7,提高SOD、GSH-Px活性,降低了自然衰老小鼠MDA、MAO在體內(nèi)的堆積,可以有效緩解自然衰老引起的一系列疾病,延緩衰老。

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