天麻對乳酸菌發(fā)酵過程中蛋白質含量變化的影響研究

黃先敏，韓立乾，陳 宇，范 莉，張可滿

昭通學院農學與生命科學學院，云南昭通 657000

0 引言

乳酸菌在人類生活中應用廣泛，已有幾千年的歷史[1]，是一種有利于人體健康的益生菌，以活的菌體進入到人體內[2]，具有幫助消化、保持腸道健康[3]、幫助鈣質吸收、防止腹瀉、癌癥[4]、消除便秘及制造維生素等作用。同時還有改善人體腸道菌群，調節(jié)機體免疫力[5]，抑腫瘤，降低血清膽固醇，調節(jié)血壓等重要的生理活性[6]。其中的保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.thermophiles）是人體腸道中的重要微生物，具有較高的經濟價值和研究價值[7]。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在酸乳發(fā)酵過程中具有不同的發(fā)酵特性，在不同的發(fā)酵時期表現(xiàn)出不同的代謝性能[8]。嗜熱鏈球菌在發(fā)酵牛乳時，具有產酸快、生長快的特點，從而營造出一種適合另一種乳酸菌（保加利亞乳桿菌）生長的酸性環(huán)境[9]。這兩種菌種互利共生，對人體起著有益作用[10]。牛乳中含有豐富的營養(yǎng)物質，兩種菌混合發(fā)酵時，先將酪蛋白降解為肽類和氨基酸，以滿足菌種對含氮類物質的需要[11]，同時將大分子物質蛋白質降解為小分子物質（氨基酸、肽）有利于人類的吸收利用。

天麻是我國傳統(tǒng)名貴中藥，已有幾千年的藥用歷史[12]。天麻中含有蛋白質、氨基酸、巴利森苷、天麻素、天麻苷元、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸以及天麻多糖等多種活性物質[13]，其中天麻素和天麻苷元是其主要的活性物質[14]。藥理研究表明，天麻素具有鎮(zhèn)靜催眠、抗癲癇、鎮(zhèn)痛、保護神經元細胞和抗氧化、抗炎、增強機體免疫力等多種作用[15，16]。巴利森苷類物質是近年來在天麻中發(fā)現(xiàn)含量較高的活性物質，是一種以結合態(tài)存在的天麻素，即天麻素和檸檬酸縮合而成的酯類成分。巴利森苷類活性物質可代謝成天麻素類衍生物，具有改善學習記憶的作用，且效果比天麻素單體更強，有望成為新一代抗癡呆藥的先導物[17～19]。天麻苷元具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗抑郁、改善記憶力、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板凝集以及腦缺血保護作用[20，21]。天麻運用在人體及其他動物方面的研究報道較多，而運用在微生物方面的研究未曾見有過報道。本論文將天麻中的有效成分提取出來，加入到乳酸菌的培養(yǎng)基中，通過測定蛋白質的含量變化，以此得出天麻提取液對乳酸菌發(fā)酵過程中蛋白質含量變化的影響情況。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

天麻（昭通市神農烏天麻良種繁育有限公司提供）；純牛奶（昆明雪蘭牛奶有限責任公司）；乳酸菌菌種為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌種（來源于來思爾裸酸奶，云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司生產）；蔗糖（云南楚雄祿豐縣平浪鎮(zhèn)舍資街）。

1.2 試驗方法

以添加純凈水的乳酸菌培養(yǎng)基為對照（CK組），對添加天麻提取液的乳酸菌培養(yǎng)基中的蛋白質含量進行測定。試驗設置6 個重復，樣品中的蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色法進行測定。蛋白質含量采用下列公式進行計算，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行分析。

1.2.1 天麻提取液的制備

準確稱取天麻粉（80 目）20.000 g于干凈燒杯中，加入200 mL的娃哈哈純凈水。用FA25高剪切分散乳化機在轉速為10 000 r/min、時間為10 min的條件下，將其攪拌均勻。將混合液分裝入離心管內，然后用A K 高速冷凍離心機離心，轉速為8 800 r/min，時間6 min，上清液為天麻提取液，倒出備用。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

CK組的乳酸菌培養(yǎng)基配方及比例：鮮牛奶62.57%、白砂糖8.39%、純凈水為16.52%；添加天麻提取液的乳酸菌培養(yǎng)基配方則是將純凈水換為天麻提取液，占整個培養(yǎng)基的比例為17%。配制好培養(yǎng)基后，按培養(yǎng)基總量的12.51%添加裸酸奶作為菌種。將接種好乳酸菌菌種的培養(yǎng)基，放在40 ℃的BIC-250人工氣候培養(yǎng)箱內進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵過程的觀察及材料的收集

將剛接種好未進行培養(yǎng)的時間設為0 min，然后每隔20 min，觀察一次，并記錄培養(yǎng)基的組織質構狀態(tài)，直到740 min為止。再根據(jù)發(fā)酵液在不同時間段組織形態(tài)及質構的變化，收集不同時間段（0 min、80 min、140 min、160 min、200 min、240 min、360 min、420 min、500 min、600 min、740 min）的發(fā)酵液進行蛋白質含量的測定分析。共收集22 份樣品（CK組和加入天麻提取液兩組培養(yǎng)基，每組各11 份樣），放入冷藏箱中備用。

1.2.4 樣品溶液的制備

將收集的發(fā)酵液在冰浴的條件下，攪拌20 min后，取5 mL發(fā)酵液，加入10 mL娃哈哈純凈水稀釋，搖晃均勻，再冰浴6 min后，倒入離心管，用HR立式高速冷凍離心機在轉速為4 000 r/min，溫度為4 ℃條件下，離心6 min。取上清液定容至50 mL的容量瓶中，待用。

1.2.5 樣品溶液的測定

取樣品溶液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍染液，充分搖晃均勻后，靜置5 min，用722N分光光度計在595 nm波長下，測其吸光度。

1.2.6 標準溶液的配制及標準曲線的制作

標準溶液的配制：稱取50 mg結晶牛血清白蛋白標品，溶解定容于50 mL容量瓶里，作為母液。分別取母液5 mL和10 mL定容至兩支50 mL的容量瓶中，配成100 μg/mL、200 μg/mL的標準溶液。再分別取0 mL、2 mL、4 mL、8 mL的100 μg/mL的標準溶液和6 mL、8 mL、10 mL的200 μg/mL的標準溶液于一組小燒杯中，加純凈水稀釋至10 mL，配制一系列濃度梯度為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL及200 μg/mL的溶液。

標準曲線的制作：取上述溶液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍染液，充分搖晃均勻后，靜置5 min，在595 nm波長下測其吸光度。以所測得的吸光度為橫坐標，質量濃度為縱坐標，可得蛋白質的標準曲線圖，如圖1。

從圖1中可見，吸光度與質量濃度間的線性關系式為y=199.74x-1.3676（R2=0.9965）。表明在0～200 μg/mL的溶液濃度范圍內，吸光度與質量濃度呈良好的線性關系。

1.2.7 儀器的精密度、準確性及重復性試驗

圖1 蛋白質標準曲線圖

取發(fā)酵80 min的CK培養(yǎng)基樣品，參照1.2.4的步驟進行冰浴、離心處理，再按照1.2.5的步驟重復6 次測定，得其吸光度。經過計算，得其RSD值為1.844%，可知儀器的精密度好、準確性高、重復性強。

2 結果與分析

2.1 兩種乳酸菌培養(yǎng)液的顯微結構

用10 倍稀釋梯度法制作發(fā)酵液的菌懸液，采用血細胞計數(shù)板進行制片，在CX40光學顯微鏡下觀察，對發(fā)酵液中的乳酸菌細胞進行拍攝，見圖2和圖3。

圖2和圖3所拍攝的是在同一發(fā)酵時間段內，發(fā)酵液中乳酸菌的顯微形態(tài)圖。從圖2和圖3中可以看出，添加純凈水的發(fā)酵液中，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的細胞相對于添加天麻提取液的細胞小且數(shù)量少，兩種發(fā)酵液中的嗜熱鏈球菌都為球形，呈分散分布狀態(tài)，保加利亞乳桿菌呈短桿狀分散分布。

圖2 添加天麻提取液的顯微圖（放大倍數(shù)10×40）

圖3 添加純凈水的顯微圖（放大倍數(shù)10×40）

2.2 兩種乳酸菌培養(yǎng)液的質構變化

設置每20 min間隔觀察一次，觀察兩組發(fā)酵液的形態(tài)和質構變化，將發(fā)酵液形態(tài)和質構變化明顯時間段的情況進行匯總，結果見表1。

從表1中可以看出，添加天麻的發(fā)酵液凝乳速度較CK組快，80 min時觀察到添加天麻的發(fā)酵液液體流動感減弱，已經開始凝乳，而CK組的發(fā)酵液還呈液體狀態(tài)；添加天麻的發(fā)酵液在200 min時黏稠感加強，到240 min時完全凝固，而CK組的發(fā)酵液在200 min時流動感才開始減弱，240 min才開始有黏稠感；CK組發(fā)酵液凝固相對于天麻提取液延后140 min。添加天麻提取液的發(fā)酵液從340～740 min間，依次出現(xiàn)凝固不均勻，四周有淡黃色液體，上層有液體析出，分層明顯的現(xiàn)象產生；而CK組的發(fā)酵液是從500～740 min間，依次出現(xiàn)凝固不均勻，四周有液體及上層有液體析出的現(xiàn)象，表明天麻提取液有促進乳酸菌生長代謝的作用。

2.3 不同發(fā)酵時間段的蛋白質的含量

將所測樣品溶液的吸光度，代入吸光度與質量濃度的線性關系式中，應用1.2的公式可得樣品溶液中的蛋白質含量（μg/mL），結果見表2。

表2 不同發(fā)酵時間段中蛋白質的含量（μg/mL）

由表2可知，添加天麻提取液的起始蛋白質含量為18 371.78 μg/mL，高于添加純凈水的起始蛋白質含量15 803.75 μg/mL，這是因為箭麻中含有蛋白質的量為6.96%[22]。添加天麻提取液的蛋白質含量在360 min時，下降到最低點，為446.24 μg/mL，CK組的蛋白質含量在420 min時，下降到最低點，為451.73 μg/mL，可見天麻提取液具有促進蛋白質降解的作用；添加天麻提取液和CK組在360～740 min和420～740 min兩個發(fā)酵時間段中的蛋白質含量變化不大。

以時間為橫坐標，不同發(fā)酵時間段的蛋白質含量為縱坐標，作成不同發(fā)酵時間段的蛋白質含量變化曲線圖，見圖4。

從圖4 中可以看出，在0 ～1 4 0 m i n 的發(fā)酵過程中，二者蛋白質含量下降的趨勢都非常平緩。這是因為二者都處于發(fā)酵前期，對于嗜熱鏈球菌來說，菌株接種后可利用牛奶中豐富的氨基酸、二肽、三肽及寡肽迅速進入對數(shù)生長期[10]。在140～160 min的發(fā)酵過程中，CK組的蛋白質含量大幅度下降。這是因為嗜熱鏈球菌對氨基酸的利用受限，使得與其共同作用的保加利亞乳桿菌開始水解蛋白質為肽類來供它生長利用[23]；而添加了天麻提取液的蛋白質含量變化幅度不大，這是因為天麻本身含有豐富的氨基酸[22]，所以發(fā)酵液中有氨基酸供給嗜熱鏈球菌生長利用。在1 6 0 ～2 0 0 m i n 的發(fā)酵過程中，添加天麻提取液和C K 組的蛋白質含量都大幅度下降，這是因為隨著乳酸菌的生長代謝，嗜熱鏈球菌開始進入穩(wěn)定期，而伴隨著p H 值的下降，保加利亞乳桿菌的生長代謝開始變得旺盛[11]。在2 4 0 ～7 4 0 m i n 的發(fā)酵過程中，二者的蛋白質含量都趨于平穩(wěn)。這是因為進入了發(fā)酵后期，保加利亞乳桿菌的生長進入了穩(wěn)定期[11]。

圖4 不同發(fā)酵時間段的蛋白質含量變化圖

2.4 發(fā)酵液中的蛋白質被乳酸菌轉化的利用率

2.4.1 蛋白質的轉化利用率

根據(jù)發(fā)酵液中的蛋白質含量出現(xiàn)的最高點和最低點，可以算出發(fā)酵液中乳酸菌對蛋白質的轉化利用率，如表3。

由表3中的數(shù)據(jù)可看出：添加天麻提取液蛋白質的轉化利用率為97.41%～97.71%，平均轉化利用率為97.56%，CK組蛋白質的轉化利用率為96.91%～97.25%，平均轉化利用率為97.14%。

2.4.2 轉化利用率的方差分析

為了進一步分析添加天麻提取液蛋白質轉化率和對照組之間是否存在差異顯著性，采用SPSS軟件進行方差分析。蛋白質的轉化利用率在96.91%～97.71%之間，要對數(shù)據(jù)進行反正弦轉換，轉換后的數(shù)據(jù)見表4。

對表4中的數(shù)據(jù)進行方差分析，分析結果見表5。由表5可知，經方差分析得F=31.38，查F臨界值表[24]，當α=0.05，α=0.01，df1=1，df2=10時，F(xiàn)0.05（1，10）=4.96，F(xiàn)0.01（1，10）=10.04，可知F＞ F0.01（1，10），說明在1%顯著水平上，添加天麻提取液和對照組之間的蛋白質轉化利用率存在極顯著差異性。

表3 蛋白質的轉化利用率

表4 蛋白質轉化利用率的反正弦值

表5 反正弦值的方差分析

3 討論

通過試驗中可以看出，添加天麻提取液的乳酸菌細胞較CK組的細胞大，同時數(shù)量多，添加天麻提取液的乳酸菌細胞的生長代謝快于CK組細胞的生長代謝。在兩種培養(yǎng)基中蛋白質的轉化率具有差異顯著性，添加天麻提取液的蛋白質降解量為17 925.54 μg/mL，CK組為15 352.02 μg/mL ，二者的降解量相差2 573.52 μg/mL。添加天麻提取液乳酸菌培養(yǎng)基中起始蛋白質的含量為18 371.78 μg/mL，CK組起始蛋白質的含量為15 803.75 μg/mL，添加天麻提取液乳酸菌培養(yǎng)基中起始蛋白質的含量高于CK 2 568.03 μg/mL。發(fā)酵結束后，兩組發(fā)酵液中的蛋白質含量相差不大，而發(fā)酵前添加天麻提取液中的蛋白質含量遠遠高于CK組，說明天麻提取液有促進乳酸菌降解轉化蛋白質的作用。

本試驗所用菌種是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，利用兩種乳酸菌混合發(fā)酵，能促進菌株的生長繁殖。乳酸菌發(fā)酵牛乳的一個重要作用是產黏，黏度的產生是由于嗜熱鏈球菌不斷產酸，p H 值下降，造成酪蛋白的凝固，乳酸菌分泌的多糖，使發(fā)酵液呈現(xiàn)出均一、黏稠的狀態(tài)[25]。在共生過程中，保加利亞乳桿菌利用蛋白酶水解乳蛋白，產生小分子的肽和游離的氨基酸，為嗜熱鏈球菌提供相應的氮[26]；同時嗜熱鏈球菌能為保加利亞乳桿菌提供生長代謝所需的酸和C O2作為輔助因子，從而促進其快速生長[27]。混合發(fā)酵還能提高氨基酸和短肽的產量，使更多的風味物質得以生成，改善酸乳的品質[28]。

本試驗在乳酸菌的培養(yǎng)基中加入天麻提取液，測定不同發(fā)酵時間段內發(fā)酵液中蛋白質的含量，可知天麻對乳酸菌發(fā)酵過程中蛋白質的降解有促進作用。天麻作用于人體的藥用功效研究較多，但在微生物方面的研究運用未曾有過報道。本試驗結果為進一步開發(fā)利用天麻的其他用途提供理論依據(jù)，同時為豐富乳酸菌可利用代謝產物找到一條新的路徑。