尿液代謝組學非靶向質(zhì)譜分析法兩種采集模式的比較

肖曉蓮，劉曉燕，朱文鳳，楊曄宏，楊俊濤，孫 偉*

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 1.藥理系；2.醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

代謝組學(metabolomics)分析方法是研究小分子代謝物的有效工具，能夠直接反映生命體終端和表型信息，在精準醫(yī)學和轉(zhuǎn)化醫(yī)學中發(fā)揮著重要作用[1-4]?；谫|(zhì)譜(mass spectrum,MS)的非靶向代謝組學分析方法已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括疾病生物標志物發(fā)現(xiàn)、代謝通路研究和尋找調(diào)節(jié)某些疾病表型的生物活性化學物質(zhì)，比如脫髓鞘病, 糖尿病或腫瘤等[5-8]。

非靶向代謝組學分析方法中常用的數(shù)據(jù)采集模式有兩種，即全掃描采集(full scan acquisition, FSA)模式和數(shù)據(jù)依賴采集(data dependent acquisition, DDA)模式。FSA模式對每個樣本進行一級質(zhì)譜圖(MS)掃描以獲得所有代謝特征的精確質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio, m/z)和相對豐度，再選擇靶向的離子掃描二級質(zhì)譜(MS/MS,MS2)圖進行代謝物的鑒定。DDA模式是在進行一級質(zhì)譜圖掃描的同時，選擇一級譜圖中的高豐度離子進行二級譜圖采集，一次實驗同時完成代謝物的定性和定量分析。以往文獻表明，不同數(shù)據(jù)采集模式會影響代謝物的鑒定和定量[9]。目前，對非靶向代謝組學分析方法的采集模式比較的研究仍很缺乏且不全面。有人使用代謝物標準品分析比較兩種模式鑒定的代謝物數(shù)目，但未進行定量比較；同時，該研究缺乏真實生物樣本的代謝物的定性定量比較，并且未考慮不同豐度及峰寬的代謝物的定性定量結(jié)果[10]。本研究擬分別用代謝物標準品混合物和健康人尿液代謝物進行兩種采集模式的質(zhì)譜分析，以從代謝物的定性及定量兩個方面，全面地比較了兩種數(shù)據(jù)采集模式進行質(zhì)譜分析的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：乙腈、甲酸(Merk公司)；水(質(zhì)譜級)、標準品：醋氨酚、咖啡因、磺胺脒、磺胺二價氧嘧啶、纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸、維拉帕米、特非那定、亮氨酸腦啡肽和利血平9種代謝物(Waters公司)；尿液：10名健康人的晨尿(晨起第一次尿液)，每人留取50 mL，4 500×g離心10 min去細胞碎片。

1.2 方法

1.2.1 標準品：標準品的質(zhì)譜分析分別采用FSA和DDA兩種模式采集，進樣2 μL，分別進行3次實驗操作重復(fù)。

1.2.2 尿液代謝物的提?。好總€尿液樣本取200 μL，加入等量乙腈混合，放置-20℃冰箱30 min后，14 000×g離心10 min，取上清吹干后加入200 μL 2%乙腈溶解。

提取尿液代謝物后，每個樣本取3 μL代謝物提取液混合成一份混合物上機。質(zhì)譜分析分別采用FSA和DDA兩種模式采集(FSA組和DDA組)，設(shè)置3個進樣量，包括1、2和4 μL，每個進樣量進行3次實驗操作重復(fù)。

1.2.3 質(zhì)譜分析代謝物：標準品混合物和尿液代謝物經(jīng)色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)進行分離，多肽的洗脫液梯度為2%～100% B液(0.1%甲酸，100%乙腈)，流速為500 μL/min，洗脫時間為17 min。洗脫的代謝物用Triple TOF5600質(zhì)譜儀分析(AB Sciex, 多倫多, 安大略省, 加拿大)，分析模式分別采用FSA模式和DDA模式。FSA模式參數(shù)如下：一級全掃描范圍為50～1 200 m/z，累積時間為0.25 s, GAS1為55 psi，GAS2為55 psi，Curtain Gas為35 psi，溫度為550 ℃，電離噴霧電壓為4 500 V；二級定性掃描碰撞能量使用20、35、50、35步長15 eV，每個循環(huán)選豐度top4一級質(zhì)譜(LC-MS)圖進行二級質(zhì)譜(LC-MS/MS)采集，動態(tài)排除時間為5 s，選擇動態(tài)背景排除。DDA模式參數(shù)如下：一級全掃描范圍為50～1 200 m/z，一級累積時間為0.25 s，二級累積時間為0.1 s，GAS1為55 psi，GAS2為55 psi，Curtain Gas為35 psi，溫度為550 ℃，電離噴霧電壓為4 500 V，二級定性掃描碰撞能量為35步長15 eV，每個循環(huán)選豐度top4一級質(zhì)譜圖進行二級質(zhì)譜采集，動態(tài)排除時間為5 s，選擇動態(tài)背景排除。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 標準品結(jié)果的分析

FSA組的9個代謝物豐度均高于DDA組(P<0.05)(圖1A)。其中，亮氨酸腦啡肽差異最明顯，在FSA組的豐度(abundance)比DDA組高約3倍。全部代謝物在FAS組的豐度比DDA組平均高約2.36倍(圖1)。

A.abundance of known metabolite; B.coefficient of technical variation；*P<0.05 compared with full scan acquisition圖1 代謝物標準品的定量分析Fig 1 Quantitative analysis of known

有8個代謝物豐度的變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)值在DDA組明顯高于FSA組，維拉帕米的豐度CV值在兩組中相近。DDA組的CV值范圍在2.14%至11.20%，F(xiàn)SA組的CV值范圍在0.81%至6.35%(圖1B)。

2.2 尿液樣本的分析

2.2.1 定性比較:進樣量為1、2和4 μL時，F(xiàn)SA組的一級譜圖數(shù)、二級譜圖數(shù)、代謝特征數(shù)目及二級譜圖匹配的代謝特征數(shù)均稍多于DDA組(表1)。

表1 兩種數(shù)據(jù)采集方法的液相二級質(zhì)譜(MS2)結(jié)果Table 1 LC-MS/MS(MS2) data of the two acquisition

進樣量為1 μL時，F(xiàn)SA組鑒定的代謝物較DDA組多9.5%。進樣量為2 μL時，兩組鑒定的代謝物數(shù)目相近。進樣量為4 μL時，F(xiàn)SA組鑒定的代謝物數(shù)目較DDA組多10%(圖2)。

*P<0.05 compared with full scan acquisition圖2 兩種采集方法尿液代謝物鑒定結(jié)果比較Fig 2 Comparison of urine metabolite number in two acquisition methods

2.2.2 定量比較:進樣量為1、2和4 μL時，DDA組的CV中位數(shù)為10.3%、7.0%和6.5%，F(xiàn)SA組的CV中位數(shù)為7.1%、3.0%和2.6%。3種進樣量中，兩組的豐度CV分布趨勢一致，DDA組的CV分布總體高于FSA組(圖3)。

A.technical CV distribution of urinary metabolites with 1 μL loading amount; B.technical CV distributionof urinary metabolites with 2 μL loading amount; C. technical CV distribution of urinary metabolites with 4 μL loading amount圖3 兩種采集方式不同上樣量尿液代謝物實驗操作CV重復(fù)性比較Fig 3 Distribution of repeatitive technical CV comparison of urinary metabolites in two acquisition methods

低豐度代謝物(質(zhì)譜信號強度10～100)中，進樣量為1、2和4 μL時，DDA組代謝物的豐度CV均數(shù)分別較FSA組高1.3、1.7和1.9倍(P<0.05)。中(信號強度100～1 000)、高(信號強度為>1 000)豐度代謝物中，進樣量為1 μL時，兩組的CV均數(shù)相近；進樣量為2和4 μL時，DDA組代謝物的豐度CV均數(shù)分別較FSA組高1.7、1.8和1.9、1.4倍(P<0.05)(圖4A)。

在峰寬時間<5 s的代謝物中，進樣量為1、2和4 μL時，DDA組的CV均數(shù)分別較FSA組高1.8、1.7和2.2倍(P<0.05)。峰寬時間為5～10 s的代謝物中，進樣量為1、2和4 μL時，DDA組的CV均數(shù)分別較FSA組高1.5、2.1和2.1倍(P<0.05)。峰寬時間為>10 s的代謝物中，進樣量為1 μL時，兩組的CV均數(shù)相近；進樣量為2和4 μL時，DDA組的CV均數(shù)分別較FSA組高2.0和2.0倍(P<0.05)(圖4B)。

A.technical CV distribution of metabolites with different abundance; B. technical CV distribution of metabolites with different chromatographic peak width; *P<0.05 compared with full scan acquisition圖4 兩種數(shù)據(jù)采集方式鑒定代謝物豐度和峰寬的實驗操作CV重復(fù)性分布比較Fig 4 Distribution of repeatitive technical CV comparison of metabolites with different abundance and chromatographic peak width in two acquisition

3 討論

本研究比較了FSA和DDA兩種質(zhì)譜采集方法在非靶向代謝組學分析方法中的結(jié)果。通過分析代謝物標準品混合樣和健康人尿液代謝物，結(jié)果表明，兩種模式都能對上述樣品進行定性定量分析，擁有各自的優(yōu)缺點。

FSA模式鑒定的代謝物數(shù)目更多，并且鑒定的代謝物豐度總體高于DDA模式，定量的重復(fù)性和準確度更高。在FSA模式中，質(zhì)譜將全部的時間用于采集一級譜圖。因此，采集代謝物色譜峰的數(shù)據(jù)點數(shù)多，定量的準確性更高；另一方面，因為有更多時間進行數(shù)據(jù)采集，可以采集到色譜峰的最高點，定量的色譜峰面積更大,因此強度更高。定性方面，F(xiàn)SA模式的二級鑒定使用了4種不同的碰撞能量，可以采集更多信息量,因此鑒定的代謝物多。以往文獻報道，在非靶向代謝組學中，F(xiàn)SA模式相比DDA模式可以捕獲更多代謝物特征，由于FSA模式采集一級譜圖的時間更多，這與本研究結(jié)果一致[10]。 但是，F(xiàn)SA模式仍存在不可忽略的問題，該模式下代謝物的定量與定性分析是分開檢測的，需要進行兩批次的質(zhì)譜分析，這對液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求高。只有色譜的保留時間在一致的情況下，才能確保兩次采集的數(shù)據(jù)具有可分析性。尤其是，對大批量樣品進行長時間分析時，技術(shù)難度相對較大。因此，該方法更適用于小規(guī)模樣品量的代謝組分析。

DDA模式可同時進行一級和二級譜圖的采集，定性與定量僅需采集一次即可實現(xiàn)。但是，由于DDA模式的一級譜圖采集分配了很大一部分采集時間用于二級譜圖的產(chǎn)生，導致錯過色譜峰的最高點，定量的峰面積較低，峰強度較低；而且，采集色譜峰的點數(shù)減少，導致定量的準確性降低。而定性方面，由于DDA模式的二級碰撞能量只有一種，采集的信息量較少。因此，鑒定的代謝物數(shù)目相對少。雖然DDA模式有以上問題，但DDA模式定量的CV在10%左右，尚在誤差允許范圍內(nèi)，定性數(shù)目也僅少10%。考慮到DDA模式對系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求相對較低，并且操作簡便，省時省樣本量，因此，其更適用于長時間大樣品量分析。

本研究全面分析了尿液代謝組學非靶向質(zhì)譜分析法常用的兩種數(shù)據(jù)采集模式，評價其各自的優(yōu)缺點，為非靶向分析方法的選擇提供了參考。