血管生成素樣蛋白3基因敲低減輕胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)生和發(fā)展

于華惠，焦曉璐，楊云云，李 凡，孫秋菊，玉 鈺，呂倩雯，秦彥文

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院；北京市心肺血管疾病研究所上氣道功能障礙相關(guān)心血管疾病北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029)

胸主動(dòng)脈瘤(thoracic aortic aneurysm，TAA)是以胸主動(dòng)脈異常擴(kuò)張為主要病變的一類疾病[1]，為心血管急危重癥，發(fā)病急劇、病死率高、預(yù)后差，臨床通常表現(xiàn)為急性胸痛[2]。未經(jīng)治療的TAA，在發(fā)病后前48 h的存活率僅有1%。即使進(jìn)行治療，病死率仍為50%[3]。目前臨床上只能通過(guò)手術(shù)治療，沒(méi)有有效的藥物控制可延緩TAA的發(fā)生發(fā)展。因此，需要尋找有效的治療靶點(diǎn)來(lái)減緩TAA的發(fā)展以降低TAA破裂的風(fēng)險(xiǎn)。

血管生成素樣蛋白(angiopoietin-like proteins, ANGPTLs)家族是一類分泌蛋白，參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-7]。ANGPTL3是ANGPTLs家族的主要成員之一，在心血管疾病中起重要作用[8]。在小鼠中ANGPTL3單克隆抗體顯著減少了動(dòng)脈粥樣硬化病變面積與脂質(zhì)壞死核心[9]。人體給予ANGPTL3反義寡核苷酸6周，致動(dòng)脈粥樣化的脂蛋白水平降低[10]。除了其在脂代謝中的作用外，該分子還具有促炎和促血管生成作用[11]。ANGPTL3單克隆抗體已進(jìn)入臨床三期試驗(yàn)[12]，是治療心血管疾病的新靶點(diǎn)。但截止目前的研究還未報(bào)道ANGPTL3是否在TAA中發(fā)揮作用。本文研究了ANGPTL3在TAA中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人體標(biāo)本收集：本研究納入了術(shù)前計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography, CT)后接受TAA常規(guī)手術(shù)的患者，所有患者均無(wú)結(jié)締組織病。對(duì)照組主動(dòng)脈組織樣本是從北京安貞醫(yī)院的心臟移植供體中獲得的。所有參與者在入組前均給予書面知情同意。該議定書經(jīng)北京安貞醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)證實(shí)，并符合《赫爾辛基宣言》。本研究已在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)(倫理審批號(hào)：ChiCTR-COC-17010792)。

1.1.2 動(dòng)物：SPF級(jí)3周齡雄性C57BL/6小鼠(北京市華阜康生物科技有限公司No.110364201100066868)。所有動(dòng)物的使用均遵循美國(guó)健康國(guó)立研究所出版的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用指南和首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用規(guī)則。

1.1.3 細(xì)胞與試劑：人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human artery smooth muscle cell,HASMC)(上海信裕生物科技有限公司)；β-氨基丙腈 (β-amino-propionitrile mono-fumarate，BAPN)和抗體IL-1β(Sigma-Aldrich公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒 (Roche公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)(Santa Cruz公司);基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP2)、ANGPTL3、GAPDH(Abcam公司); 二抗(CST公司)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記免疫組化二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 BAPN誘導(dǎo)小鼠胸主動(dòng)脈瘤模型：將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=15)和主動(dòng)脈瘤(TAA)模型組(n=15)。每天喂以新鮮配制并溶解在飲用水中的BAPN(1 g/kg)，28 d后收取小鼠組織。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)、白介素6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鈉(pH=6.0)抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶抑制劑20 min。PBS洗3次，各3 min。血清封閉30 min后，吸去血清，加入相應(yīng)一抗，4 ℃濕盒過(guò)夜。次晨取出濕盒室溫放置30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，各3 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫1 h，PBS洗3次，各3 min。DAB 顯色。使用配備DS-Ri2彩色CCD的Ni-UNikon立式顯微鏡獲得圖像后，用 Image-J 軟件分析。

1.2.3 HASMCs的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將HASMCs培養(yǎng)于含有10%胎牛血清FBS及1%的青霉素/鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中，置于含有5% CO2、37 ℃孵箱。將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，siRNA組加入ANGPTL3 siRNA(10 μg)和轉(zhuǎn)染試劑(10 μL)后培養(yǎng)，24 h后換液為完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為：對(duì)照組、ANGPTL3siRNA(10 μg)組、AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ +ANGPTL3siRNA組。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平：Trizol法提取細(xì)胞RNA。使用Nanodrop 2000測(cè)定細(xì)胞RNA濃度。將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，分別加入2×SYBR GREEN PCR Master Mix 10 μL、RNase Free H2O 9 μL和上下游引物各0.5 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。混勻后加入到上述各管中，使用帶有SYBR Green I的iQ5系統(tǒng)用于實(shí)時(shí)qPCR。通過(guò)在95 ℃孵育5 min，然后在95 ℃進(jìn)行45 s和60 ℃進(jìn)行60 s的45個(gè)循環(huán)來(lái)擴(kuò)增樣品。管家基因GAPDH用作對(duì)照。相對(duì)mRNA水平使用2-ΔΔCt方法計(jì)算，并標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDHmRNA水平。引物序列分別為：Bax:上游引物：5′-TGAAGACAGGGGC CTTTTTG-3′，下游引物：5′-AATTCGCCGGAGACAC TCG-3′；Bcl-2:上游引物：5′-GTCGCTACCGTCGTG ACTTC-3′，下游引物：5′-CAGACATGCACCTACCC CAGC-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TAA患者胸主動(dòng)脈中ANGPTL3表達(dá)

與對(duì)照組相比，TAA患者主動(dòng)脈ANGPTL3表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖1A，B)。

A.representative immunostaining of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control transplant donors(×400)； B.semiquantitative analysis of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control transplant donors; *P<0.05 compared with control group(transplant donors)圖1 ANGPTL3在人胸主動(dòng)脈瘤組織中增加Fig 1 ANGPTL3 was increased in human thoracic aortic aneurysm (TAA)

2.2 BAPN誘導(dǎo)小鼠TAA

與對(duì)照組相比，TAA模型組小鼠胸主動(dòng)脈明顯擴(kuò)張(圖2A)。TAA模型組的死亡率為60%(P<0.05)(圖2B)，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。TAA模型組小鼠主動(dòng)脈中凋亡水平、IL-6、MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖2C～F)。

A.representative images of TAA features in male C57BL/6 mice；B.survival curve showing the survival of mice four weeks after BAPN administration; C.TUNEL assay and semi-quantitative analysis of aortas in control and TAA groups；scale bars: 100 μm (×200)；D.immunohistochemical staining and semi-quantification of IL-6 expression in aortic lesions of control and TAA groups (P<0.05)(×400)；E.immunohistochemical staining and semi-quantification of MMP9 expression in aortic lesions of control and TAA groups (P<0.05)(×400)；F.immunohistochemical staining and semi-quantification of MMP2 expression in aortic lesions of control and TAA groups (P<0.05)(×400)；*P< 0.05 compared with control group圖2 TAA小鼠模型主動(dòng)脈組織中凋亡、炎性反應(yīng)和MMPs表達(dá)增加Fig 2 Apoptosis, inflammation and MMPs expression were increased in TAA

2.3 TAA小鼠中ANGPTL3的表達(dá)顯著增加

TAA小鼠主動(dòng)脈ANGPTL3表達(dá)顯著上升(P<0.05)(圖3A，B)。ANGPTL3在TAA小鼠中與平滑肌細(xì)胞存在大量共定位表達(dá)(圖3C)。

A.representative immunostaining of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control mice(×400)；B.semiquantitative analysis of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control mice, *P<0.05 compared with control group；C.co-staining of a-SMA (red) and ANGPTL3(green)(×400)圖3 ANGPTL3在TAA小鼠胸主動(dòng)脈中增加Fig 3 ANGPTL3 was increased in mice thoracic aortic aneurysm (TAA)

2.4 敲低ANGPTL3可顯著減輕AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs凋亡

AngⅡ以時(shí)間-濃度依賴性方式促進(jìn)ANGPTL3在HASMCs中的表達(dá)(P<0.05)(圖4A，B)。ANGPTL3 siRNA可以顯著抑制HASMCs中ANGPTL3的表達(dá)(P<0.05)(圖4C)。ANGPTL3敲低后可以顯著降低凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3、caspase-9的表達(dá)(P<0.05)(圖5A～C)。促凋亡相關(guān)基因Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05)(圖5D)，而抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)(圖5E)。

A.ANGPTL3 levels in HASMCs were increased after AngⅡ treatment with 25, 50, or 100 nmol/L AngⅡ for 24 hours, as assessed by Western blot；B.ANGPTL3 levels in HASMCs were increased after AngⅡ treatment with 12, 24, or 48 hours AngⅡ for 100 nmol/L, as assessed by Western blot；C.ANGPTL3 siRNA decreased the expression of ANGPTL3 in HASMCs；*P< 0.05 compared with control group圖4 在AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs中ANGPTL3的表達(dá)隨濃度-時(shí)間增加Fig 4 ANGPTL3 expression was increased in angiotensin Ⅱ (AngⅡ)-induced

A.caspase-3 and caspase-9 protein levels assessed by Western blot；B.caspase-3 protein levels assessed by semiquantitative analysis；C.caspase-9 protein levels assessed by semiquantitative analysis；D.real-time PCR revealed the expression of Bax；E.real-time PCR revealed the expression of Bcl-2；*P< 0.05 compared with AngⅡ group圖5 敲低ANGPTL3降低了AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs的凋亡Fig 5 ANGPTL3 knockdown decreased AngⅡ-induced HASMCs

2.5 敲低ANGPTL3可顯著減輕AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs中炎性因子表達(dá)

ANGPTL3敲低可以顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的HASMCs中炎性因子IL-6、IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖6A，B)。

A.IL-6 and IL-1β protein levels assessed by Western blot；B.IL-6 and IL-1β protein levels assessed by semiquantitative analysis；*P<0.05 compared with AngⅡ group圖6 敲低ANGPTL3降低了AngⅡ刺激的HASMCs的炎性因子表達(dá)Fig 6 ANGPTL3 knockdown decreased AngⅡ-induced HASMCs

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)了ANGPTL3在人TAA組織中的表達(dá)增加，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確ANGPTL3在TAA組織中表達(dá)增加且與平滑肌細(xì)胞共定位。進(jìn)一步細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低ANGPTL3后可以減輕平滑肌細(xì)胞的凋亡以及炎性因子表達(dá)。這些結(jié)果表明，抑制ANGPTL3可能減輕TAA的發(fā)生發(fā)展。

目前胸主動(dòng)脈瘤的主要病理生理學(xué)機(jī)制包括氧化應(yīng)激，平滑肌細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)激活等。炎性細(xì)胞和凋亡的平滑肌細(xì)胞分泌的蛋白酶進(jìn)一步引起血管管壁退行性變，包括細(xì)胞外基質(zhì)降解和中層彈力纖維斷裂，最終導(dǎo)致胸主動(dòng)脈瘤發(fā)生。主動(dòng)脈瘤體出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，通過(guò)分泌多種炎性因子及蛋白酶，進(jìn)一步放大炎性反應(yīng)，從而加重疾病進(jìn)展。越來(lái)越多的研究表明，ANGPTL3可能參與炎性反應(yīng)，并在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10,13]。本研究中也發(fā)現(xiàn)ANGPTL3在小鼠TAA組織中與平滑肌細(xì)胞存在大量共定位，這表明ANGPTL3可能通過(guò)調(diào)控平滑肌細(xì)胞參與動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展。在平滑肌細(xì)胞中敲低ANGPTL3可以抑制炎性因子IL-1β、IL-6的表達(dá)，并且平滑肌細(xì)胞凋亡明顯減輕，且促凋亡基因明顯降低，抑凋亡基因明顯升高。

綜上所述，敲低ANGPTL3后可能通過(guò)減輕平滑肌細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)從而減輕TAA的發(fā)生發(fā)展。本研究為探討TAA的分子機(jī)制及其防治提供了新的思路及靶點(diǎn)。