人胚胎腎細胞系HEK293中的翻譯調控

柳 滿，任 悅，高玉風，王 芳，余 佳

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室, 北京 100005)

人胚胎腎細胞系 293 (human embryonic kidney cell line，HEK293) 是一種最初來源于組織培養(yǎng)的人胚胎腎細胞的特殊細胞系。HEK293細胞是1973年在荷蘭萊頓的 Alex van der Eb 實驗室通過將健康人胚胎腎細胞中轉化入人5型腺病毒DNA 片段培養(yǎng)轉化而產生的。這種轉化導致病毒基因組中大約4 500個堿基整合到人類HEK細胞的19號染色體中。這些細胞是來自于健康流產的胎兒，其母親的身份和流產的原因尚不清楚。HEK293之所以這樣命名，是因為它是 Graham 的第293次實驗[1-2]。從細胞結構看 HEK293細胞具有復雜的核型，每條染色體有2個或更多的拷貝，被稱為亞三倍體，染色體數(shù)目為64[3]。HEK293細胞具有轉染效率高、易于大規(guī)模培養(yǎng)、表達蛋白結構接近其在體內的構象等特點。目前，HEK293細胞被廣泛應用于蛋白質互作研究、藥物篩選以及重組腺病毒包裝等方面[4-6]。

翻譯是蛋白質生物合成中的關鍵步驟，而翻譯調控對于翻譯過程來說具有重要意義。翻譯的調控是十分精密復雜的，相比于轉錄調控，翻譯調控更迅速、更高效，且可以通過對翻譯的調控進一步控制不同蛋白的空間特異性以及彌補錯誤轉錄造成的危害[7]。目前，HEK293細胞在生物學領域應用較廣，是大家公認的一種工具細胞系。而對于HEK293細胞基本翻譯狀態(tài)、翻譯調控的研究及相關報道卻比較少。本文主要對HEK293細胞中翻譯調控進行研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人胚胎腎細胞系HEK293(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基(Solarbio 公司)；胎牛血清FBS和PBS(Gibco公司)；RNase Inhibitor 和 RQ1 RNase-Free DNase(Promega 公司)；抗RPL10A抗體、抗RPL36抗體、抗RPL22抗體和抗 RPS17 抗體均(Abcam 公司)；DynabeadsTMProtein A(Thermo Fisher Scientific 公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(Beyotime 公司)；建庫及測序(Novogene 公司)。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細胞的培養(yǎng)：將HEK293細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，鋪板至匯合度為30%左右，置于含5% CO2的37 ℃的細胞箱中培養(yǎng)。每隔 2～3 d進行傳代培養(yǎng)，傳代時先用胰蛋白酶將其消化至晃動培養(yǎng)皿大部分細胞脫落后，立即用含有血清的培養(yǎng)基進行終止消化，隨后進行離心，細胞計數(shù)，鋪板傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Polysome profiling實驗檢測翻譯活躍程度：用cycloheximide(100 μg/mL)處理HEK293細胞，培養(yǎng)箱孵育15～30 min后收集細胞，DPBS洗2遍后液氮速凍，-80 ℃冰箱保存待用。MCB裂解液冰上裂解細胞30 min，在裂解過程中吹打2～3次，5 000 r/min，離心5 min。取上清液后再次進行15 000 r/min，離心10 min。取上清液進行上樣超速離心。SW41Ti 水平轉頭，38 000 r/min, 離心 2 h 45 min。超速離心結束后進行蔗糖梯度分離，分離后收取核糖體各個組分并向組分中加入95%乙醇，同時加入少量糖原助沉，vortex 充分混勻，-20 ℃孵育過夜。

1.2.3 RPL10A 和 RPS17 的 RIP-seq 實驗檢測參與翻譯過程中的mRNA：配置細胞裂解液，并用清洗液對磁珠進行預清除，每10 cm培養(yǎng)皿細胞加入800 μL裂解液，冰上裂解30 min，每10 min用移液槍吹打1次。12 000 r/min，離心15 min，吸取上清液，留出蛋白與RNA的Input，將細胞裂解后上清液分別與RPL10A和RPS17抗體以及beads 進行4 ℃ rotator 孵育過夜。次日用清洗液進行清洗，取出部分作為Input，IgG，IP用作Western blot實驗蛋白樣品，隨后 Western blot 實驗進行蛋白質量控制驗證。其余部分提取 RNA，作為建庫測序樣品，并進行 RIP-Seq 建庫測序分析。

1.2.4 RIP-Seq(RNA immunoprecipitation coupled with sequencing)建庫測序及生物信息學分析：采用新英格蘭 BioLabs(Illumina)的NEBNext Ultra RNA文庫制備試劑盒進行cDNA文庫構建，并在Illumina HiSeq X Ten平臺上機進行雙端150測序。每組文庫重復測序2次。對原始測序數(shù)據(jù)去除接頭后，得到可用的 clean 數(shù)據(jù)，使用 fastqc 對其進行質量評估。使用 Tophat2(版本2.1.1)將clean 數(shù)據(jù)比對到人類 rRNA 序列上評估建庫質量，參數(shù)設置為-min-intron-length 20-max-multihits 1-library-type fr-unstranded。同時，使用同樣參數(shù)設置將 clean 數(shù)據(jù)比對到人類基因組(Ensembl hg38.83)。去除多重比對后，使用 htseq(版本0.12.4)計算表達量，DEseq2(版本1.18.1)計算差異基因。以 log2(fold-change)>2，P<0.05 為標準分別篩選IP 及 gG 特異基因，同樣以log2(IP/IgG fold-change)>2，P<0.05進一步豐富IP組特異基因，將兩部分IP組特異基因定義為RIP靶基因。

2 結果

2.1 HEK293 細胞翻譯狀態(tài)較為活躍

Polysome profiling 結果顯示(圖1)，HEK293 細胞核糖體組分40S、60S、80S、Polysome 峰分布明顯且吸光度(absorbance，Abs) 數(shù)值較高，核糖體各組分濃度較高。Polysome 峰數(shù)目多， HEK293 細胞處于較高的翻譯活性狀態(tài)。與此同時，用核糖體大亞基蛋白 10A(ribosomal protein L10a，RPL10A)、核糖體大亞基蛋白22(ribosomal protein L22，RPL22)、核糖體大亞基蛋白36(ribosomal protein L36，RPL36) 和核糖體小亞基蛋白 17(ribosomal protein S17，RPS17) 對Polysome profiling實驗進行質量控制驗證，發(fā)現(xiàn)RPL10A、RPL22和RPL36主要分布于核糖體組分60S、80S和多聚峰，RPS17主要分布于核糖體組分40S、80S和多聚峰。根據(jù)其核糖體蛋白準確分布情況，可以證明其實驗的準確性。

Polysome profiling was used to detect translational activity of HEK293 cells, Western blot was used to verify the distribution of ribosomal proteins圖1 HEK293 細胞的翻譯活性的檢測Fig 1 Detection of translational activity of HEK293 cells

2.2 RPL10A 的 RIP 實驗結果

RPL10A抗體可以特異性富集細胞內源性RPL10A蛋白(圖2A)。接下來對富集到的RNA進行建庫測序分析(圖2B)。根據(jù)測序結果顯示，RPL10A共富集577 個特異性基因，其 IP特有占90.9%，IP和IgG共有占1.6%。同時對富集到的特異性基因進行了基因類型注釋(圖2C)?；蝾愋椭饕獮榈鞍踪|編碼基因占比83.2%、轉錄未加工假基因占比4.3%、反義 RNA 占比4.2%、長鏈非編碼 RNA 占比3.8%。

A.protein expression of RPL10A detected by Western blot；B.Venn diagram of immunoprecipitated RNAs with RPL10A and IgG；C.gene types of specific immunoprecipitated RNAs with RPL10A圖2 RPL10A 的 RIP-seq 實驗結果分析Fig 2 Analysis of RIP-seq for RPL10A

2.3 RPS17 的 RIP 實驗結果

RPS17 抗體可以特異性富集細胞內源性RPS17蛋白(圖3A)。接下來對富集到的RNA進行RIP-Seq建庫測序分析(圖3B)。根據(jù)測序結果顯示，RPL10A抗體共富集740 個基因，其中 IP 特有占 52.8%，IP和IgG共有占24.1%。同時對富集到的特異性基因進行了基因類型注釋(圖3C)?；蝾愋椭饕獮榈鞍踪|編碼基因占比90.8%、長鏈非編碼RNA占比3.0%、反義 RNA 占比1.9%、轉錄未加工假基因占比1.5%。

A.potein expression of RPS17 determined by Western blot；B.Venn diagram of immunoprecipitated RNAs with RPS17 and IgG；C.gene types of specific immunoprecipitated RNAs with RPS17圖3 RPS17的RIP實驗結果分析Fig 3 Analysis of RIP for RPS17

2.4 RPL10A和RPS17 RIP-seq實驗結果比較分析

在 RPL10A和RPS17的RIP-seq 實驗富集到的基因比較分析中發(fā)現(xiàn)共有 129 個基因(圖4A)，其中93.8% 為蛋白編碼基因(圖4B)。與此同時，對這 129 個基因進行了功能富集分析(圖4C)，發(fā)現(xiàn)涉及到 RNA 剪接、分解代謝過程的負調控、應激激活的絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)的正調控、對含砷物質的反應、細胞對未折疊蛋白的反應、蛋白質染色體定位、RNA 轉運等。其中 RNA 剪接最為顯著，其包含的基因有氯核苷酸敏感通道 1A基因(chloride nucleotide-sensitive channel 1A，CLNS1A)、白細胞介素細胞因子基因(cytokine，IK)、核仁蛋白基因(nucleolin，NCL)、橋粒相關蛋白基因(pinin，PNN)、CCCH 型鋅指 2基因(zinc finger CCCH-type，ZRSR2)、mRNA 前體加工因子 3基因(pre-mRNA processing factor 3，PRPF3)、甲狀腺激素受體相關蛋白 3基因(thyroid hormone receptor associated protein 3，THRAP3)、RNA結合基序蛋白6基因(RNA binding motif protein 6，RBM6)、 絲氨酸/精氨酸相關核基質蛋白 1基因(serine and arginine repetitive matrix 1，SRRM1)、人體免疫缺陷病毒1 型反式激活蛋白特異性因子1基因(HIV-1 Tat specific factor 1，HTATSF1)、G蛋白修補結構域蛋白 1基因(G-patch domain containing 1，GPATCH1)、核旁斑點結構蛋白1基因(paraspeckle component 1，PSPC1)、細胞分裂周期與凋亡調控因子1基因(cell division cycle and apoptosis regulator 1，CCAR1)等(表1)。

A.Venn diagram of specific immunoprecipitated RNAs with RPL10A and RPS17；B.gene types of shared immunoprecipitated RNAs with RPL10A and RPS17；C.gene ontology enrichment of 129 shared RNAs圖4 RPL10A和RPS17的RIP實驗結果分析Fig 4 Analysis of RIP between RPL10A and RPS17

表1 功能富集分析中的 RNA 剪接相關條目Table 1 RNA splicing in gene ontology enrichment analysis

3 討論

本文通過對 HEK293 細胞進行翻譯調控的研究中發(fā)現(xiàn)，通過測序分析獲得的 RPL10A 和 RPS17 數(shù)據(jù)結果交集部分不大，主要考慮以下幾點原因：第一，抗體的特異性。每一種抗體都存在特異性的問題，不同的抗體特異性的差異會很大，難以避免在實驗過程中獲得的分子類型以及數(shù)目的差異。第二,不同的核糖體蛋白在翻譯的過程中所處的空間位置的差異[8]。RPL10A位于核糖體的大亞基，而RPS17位于的小亞基，不同的空間位阻決定了不同的IP效率。綜合以上兩點原因分析，可以進一步理解為什么本文在兩種不同核糖體蛋白的情況下僅有129個共同基因，但通過對這129個共同基因的進一步分析中發(fā)現(xiàn)，這些基因中有93.8%為蛋白編碼基因，說明實驗的準確性。對共同富集的 129 個基因進行了基因功能富集分析，結果表明RNA剪接最為顯著，說明RNA剪接基因在HEK293細胞的翻譯過程中較為活躍。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中活躍翻譯基因的主要功能為RNA剪接。