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    胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

    2021-05-12 09:14:52王菊寧霍宇寧任淑婷
    生物化工 2021年2期
    關(guān)鍵詞:甘露醇高糖酸鈉

    王菊寧,霍宇寧,任淑婷

    (1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部,陜西西安 710061;2.西安培華學(xué)院,陜西西安 710125)

    糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)發(fā)病過程中最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1],其主要病理改變之一是腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增多最終導(dǎo)致的腎小球硬化。高血糖是引發(fā)DN發(fā)生和發(fā)展的主要因素。近年研究發(fā)現(xiàn),硒具有類胰島素樣作用,能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性,促進(jìn)靶組織利用葡萄糖,在降血糖的同時(shí)不增加血液中的胰島素水平[2]。本研究擬探討胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉在高糖環(huán)境下對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    人腎小球系膜細(xì)胞株(Human Mesangial Cell,HMC),西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科付榮國(guó)教授提供;胰島素,徐州萬邦金橋制藥有限公司;亞硒酸鈉,西安赫特生物公司;胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS),以色列 Biological Industries;DMEM培養(yǎng)基,美國(guó)Hyclone公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8),碧云天生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、甘露醇、二甲亞砜,美國(guó)Sigma。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    復(fù)蘇HMC進(jìn)行培養(yǎng),制備0.5×105cell/mL的HMC細(xì)胞懸液接種于96孔板,每孔100 μL,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后更換含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化,然后再給予細(xì)胞不同處理。

    1.3 葡萄糖誘導(dǎo)HMC增殖模型的建立

    采用濃度為 0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L 和35 mmol/L的葡萄糖溶液處理HMC細(xì)胞,觀察處理24 h后細(xì)胞增殖情況確定誘導(dǎo)HMC增殖的最佳葡萄糖濃度。為了觀察高糖引起溶液滲透壓增高后是否對(duì)細(xì)胞增殖有影響,除未給予任何處理的正常對(duì)照組(Control)外,同時(shí)增設(shè)與最佳葡萄糖濃度相當(dāng)?shù)?0 mmol/L高滲甘露醇組(Mannitol),觀察HMC在葡萄糖和高滲甘露醇作用下48 h內(nèi)的增殖情況。

    1.4 胰島素或胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉抑制HMC增殖

    為了明確胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制作用及其最佳抑制劑量,以未給予任何處理的空白對(duì)照組(Control)和30 mmol/L甘露醇處理的高滲甘露醇組(Mannitol)作陰性對(duì)照,在最佳葡萄糖濃度誘導(dǎo)HMC增殖的條件下,再給予3個(gè)不同濃度(30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL)的胰島素處理,與葡萄糖單獨(dú)處理的高糖模型組(Glucose)比較,觀察胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)48 h內(nèi)細(xì)胞增殖的抑制作用,篩選出胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖抑制作用的最佳處理濃度。

    在得到最佳胰島素處理濃度后,基于以往對(duì)胰島素與亞硒酸鈉的最佳配伍研究[3],分別給予最佳濃度胰島素單獨(dú)處理(Insulin)、或胰島素與相應(yīng)濃度亞硒酸鈉聯(lián)用處理(Insulin+Sodium Selenite)高糖誘導(dǎo)后的HMC,觀察胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖誘導(dǎo)48 h內(nèi)細(xì)胞增殖的抑制效果。

    1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

    細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入100 不同新培養(yǎng)基和10 基和同時(shí)間點(diǎn)后溶液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用Graphpad Prism 5 XML Project軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間比較利用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高糖誘導(dǎo)HMC的增殖

    通過檢測(cè)細(xì)胞活性,明確高糖對(duì)HMC的增殖作用。用不同濃度的葡萄糖處理HMC 24 h后,檢測(cè)HMC的相對(duì)細(xì)胞活性,結(jié)果如圖1a所示。隨著葡萄糖濃度(5~35 mmol/L)的增加,相對(duì)細(xì)胞活性均較正常對(duì)照組(0 mmol/L Glucose)顯著增加(P<0.05);且當(dāng)葡萄糖濃度為30 mmol/L時(shí),細(xì)胞相對(duì)活性達(dá)到峰值。因此,后續(xù)研究選用30 mmol/L葡萄糖作為誘導(dǎo)HMC增殖的最佳濃度。

    以未給予任何處理的細(xì)胞作為正常對(duì)照組(Control),檢測(cè)30 mmol/L葡萄糖(Glucose)和甘露醇(Mannitol)誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)HMC相對(duì)細(xì)胞活性的影響,結(jié)果如圖1b所示。與正常對(duì)照組和高滲甘露醇組相比,高糖(30 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)HMC 24 h、36 h和48 h的相對(duì)細(xì)胞活力均顯著性上升(P<0.05),且呈時(shí)間依賴性;而高滲甘露醇組與正常對(duì)照組相比,其相對(duì)細(xì)胞活力無顯著性差異(P>0.05)。

    圖1 高糖誘導(dǎo)HMC增殖情況

    2.2 胰島素或胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖環(huán)境下HMC增殖的影響

    如圖2a和2b所示,胰島素處理后24 h和48 h,與高糖模型組(Glucose)比較,3個(gè)不同濃度胰島素處理組的相對(duì)細(xì)胞活力均顯著性降低(P<0.05),其中100 mU/mL胰島素組的細(xì)胞活力最低,提示胰島素可有效抑制高糖誘導(dǎo)HMC的增殖,且以100 mU/mL胰島素處理組的抑制效果最明顯。

    圖2 胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的影響

    基于以往對(duì)胰島素與亞硒酸鈉的最佳配伍研究[3],選擇100 mU/mL胰島素聯(lián)合500 ng/mL亞硒酸鈉作為胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。圖3結(jié)果顯示,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),與高糖模型組(Glucose)相比,100 mU/mL胰島素處理組(Insulin)和100 mU/mL胰島素+500 ng/mL亞硒酸鈉處理組(Insulin + Sodium Selenite)的相對(duì)細(xì)胞活力均明顯下降(24 h、36 h、48 h均P<0.05);與單獨(dú)胰島素處理組(Insulin)相比,胰島素+亞硒酸鈉組(Insulin + Sodium Selenite)的相對(duì)細(xì)胞活力降低更顯著(48 h,P<0.05)。由此可見,胰島素及胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉均可顯著抑制高糖環(huán)境下HMC的異常增殖,而胰島素聯(lián)合亞硒酸的抑制效果優(yōu)于同等劑量單獨(dú)胰島素。

    圖3 胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的影響

    3 結(jié)論

    腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖是DN的一個(gè)重要病理特征。本研究證實(shí),30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)HMC的細(xì)胞增殖顯著且具有時(shí)間依賴性,而不同濃度(30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL) 的 胰 島素可顯著抑制高糖誘導(dǎo)HMC的異常增殖,使細(xì)胞活性顯著下降,其中100 mU/mL胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制效果最為顯著,該濃度胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉按1∶5使用后,對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制效果更加顯著,提示胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉可能會(huì)對(duì)糖尿病腎病引起的腎小球硬化具有重要的防治作用。

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