商業(yè)酵母在葡萄酒工業(yè)化生產(chǎn)中的定殖情況分析

孫悅，楊慧敏，何榮榮，張軍翔

商業(yè)酵母在葡萄酒工業(yè)化生產(chǎn)中的定殖情況分析

1寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，銀川 750021；2西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100

【】揭示商業(yè)活性干酵母（active dry yeast，ADY）在葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中的定殖情況，及其與我國本土釀酒酵母菌株的遺傳關(guān)系，為我國本土優(yōu)良釀酒酵母的選育提供理論依據(jù)，同時為葡萄酒生產(chǎn)中ADY的使用提供參考。以寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的‘赤霞珠’葡萄為原料，分別接種BDX、XR、FR和FX10四種ADY發(fā)酵，于接種后的1、3和5 d取樣。利用Interdelta和SSR技術(shù)對釀酒酵母進(jìn)行菌株區(qū)分，分析商業(yè)ADY在不同發(fā)酵階段的數(shù)量、比例以跟蹤其定殖能力。利用PopGen32軟件分析其遺傳多樣性相關(guān)指數(shù)，采用NTsys2.10e軟件揭示商業(yè)酵母與寧夏本土酵母的遺傳關(guān)系。4種ADY共顯示出6種Interdelta指紋圖譜即6種基因型：XR和FR均由2種株系組成，BDX和FX10均由1種基因型組成。對于本研究選取的9個微衛(wèi)星位點(diǎn)而言，每種ADY均顯示出1種基因型。4個發(fā)酵中共分離到225個釀酒酵母單菌落，Interdelta分析顯示42種基因型，其中本土基因型為36種，菌株變異程度為中等16%（36/225）；SSR分析顯示20種基因型，其中本土基因型為16種，處于中等遺傳多樣性水平。9個微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測出75個等位基因，平均每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)為8.3333個，觀測雜合度（Ho）在0.2000—0.5000，PIC在0.6339—0.8620，平均值為0.7614，均為高度多態(tài)性位點(diǎn)。接種BDX的發(fā)酵中本土基因型最豐富（11種Interdelta類型和8種SSR類型），接種FR的發(fā)酵次之（11種Interdelta類型和6種SSR類型）。商業(yè)ADY沒有在發(fā)酵的各個階段占據(jù)主導(dǎo)地位，對于不同的發(fā)酵階段而言，優(yōu)勢釀酒酵母的基因型也存在差異。Interdelta分析和SSR分析均顯示FR不是相應(yīng)發(fā)酵中的優(yōu)勢菌株。BDX雖然存在于整個發(fā)酵過程中，但只在接種后的3 d占主導(dǎo)地位。接種XR和FX10的發(fā)酵中，Interdelta分析法顯示它們不是發(fā)酵中的主導(dǎo)菌株，而SSR分析顯示它們均是相應(yīng)發(fā)酵中的主導(dǎo)菌株。本土釀酒酵母基因型β（SSR類型為BDX-7）、基因型γ（SSR類型為BDX-6）、基因型A（SSR類型為XR）、基因型a（SSR類型為FX10）、基因型b（SSR類型為FX10）、基因型bb（SSR類型為FR-2）和基因型ee（SSR類型為FR-4）等在相應(yīng)的發(fā)酵中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭力。聚類分析表明，分離自相同發(fā)酵中的釀酒酵母菌株間遺傳差異性較大。葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中本土釀酒酵母基因型豐富，發(fā)酵是由本土酵母與商業(yè)酵母共同參與完成的，且二者在發(fā)酵中相互競爭，數(shù)量動態(tài)演替。

活性干酵母；接種發(fā)酵；菌株區(qū)分；葡萄酒；微衛(wèi)星

0 引言

【研究意義】酵母菌在葡萄酒釀造過程中起著重要的作用，酵母菌是將糖轉(zhuǎn)化為酒精、二氧化碳以及多種次級代謝產(chǎn)物的主要微生物。目前，我國葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)大都使用接種商業(yè)化的活性干酵母（active dry yeast，ADY）進(jìn)行葡萄酒的釀造與生產(chǎn)，利用商業(yè)ADY釀造葡萄酒可以縮短遲滯期，使酒精發(fā)酵過程得到有效控制，從而提高葡萄酒質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量的均一化。但是，由于本土釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭能力，接種的ADY在酒精發(fā)酵過程中的主導(dǎo)地位得不到保證[1-2]。長期使用ADY可能導(dǎo)致我國本土微生物多樣性受減和葡萄酒同質(zhì)化的后果。釀酒酵母是決定葡萄酒最終質(zhì)量的重要因素之一，不同釀酒酵母菌株的代謝產(chǎn)物存在差異，因而會影響葡萄酒的風(fēng)味和獨(dú)特性。因此，對葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)過程中釀酒酵母菌株多樣性進(jìn)行監(jiān)控，分析發(fā)酵過程中不同酵母菌株的數(shù)量優(yōu)勢關(guān)系，對于發(fā)酵過程的有效控制及提升我國葡萄酒質(zhì)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及不同世代測序技術(shù)的深入發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母菌株水平上的區(qū)分，如核型分析法、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記法（RAPD）、線粒體DNA限制性片段長度多態(tài)性分析（mtDNA-RFLP）、Interdelta指紋圖譜法以及COX1基因指紋圖譜法等。ADY在葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中的定殖情況在西班牙[2-4]、意大利[5]、加拿大[6]等國家已有相關(guān)報道。Gil-Díaz等[1]對西班牙馬德里葡萄酒產(chǎn)區(qū)的30個工業(yè)發(fā)酵進(jìn)行了分析，結(jié)果表明接種的ADY在整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢地位得不到保證，只有9個發(fā)酵中ADY的占比達(dá)到80%以上，而在16個發(fā)酵中接種的ADY占比低于50%。Lange等[6]比較了加拿大不列顛哥倫比亞省3個酒廠的ADY定殖情況及其在整個發(fā)酵中的持久性，發(fā)現(xiàn)ADY的定殖能力以及在發(fā)酵中的持久性存在明顯的逐年變化；但沒有發(fā)現(xiàn)明顯的影響商業(yè)酵母在發(fā)酵中所占比例的因素。葡萄酒生產(chǎn)中，ADY不占主導(dǎo)地位的原因主要包括接種方法不規(guī)范[2,7]、發(fā)酵工藝操作影響[7-8]以及ADY與本土酵母間的互作[1-2]等3個因素的影響。ADY與我國本土釀酒酵母在發(fā)酵過程中的競爭關(guān)系，以及對我國本土釀酒酵母菌株多樣性的影響少見報道。何娟等[9]對貴人香冰酒生產(chǎn)中酵母菌群結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明商業(yè)酵母LVCB在整個發(fā)酵過程中一直處于主導(dǎo)地位。宋育陽等[10]以寧夏‘黑比諾’葡萄為原料，研究接種商業(yè)酵母RC212發(fā)酵中釀酒酵母菌株動態(tài)變化時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期和中期本土釀酒酵母占主導(dǎo)地位，而RC212只在發(fā)酵后期占主導(dǎo)地位?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)位于東經(jīng)105°45′—106°47′，北緯37°43′—39°23′，為賀蘭山東麓洪積傾斜平原與黃河沖積平原交匯地帶，屬于中溫帶干旱氣候區(qū)[11]。該產(chǎn)區(qū)生境特殊，蘊(yùn)含著豐富的本土微生物菌資源，為葡萄酒釀造創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。但該產(chǎn)區(qū)葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中ADY與本土釀酒酵母在發(fā)酵過程中的競爭關(guān)系，以及對本土釀酒酵母菌株多樣性的影響尚無全面、系統(tǒng)的監(jiān)控?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以‘赤霞珠’葡萄為原料，通過對其接種發(fā)酵過程中的3個時期分離的釀酒酵母菌株遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，揭示商業(yè)ADY（BDX、XR、FR和FX10）在酒精發(fā)酵中的地位，及其與本土釀酒酵母菌株間的數(shù)量競爭關(guān)系，為選育優(yōu)良本土釀酒酵母菌株，生產(chǎn)具有地域特色葡萄酒奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年在寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的4個葡萄酒酒莊進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 葡萄原料 ‘赤霞珠’：糖225—247 g?L-1，總酸4.4—6.5 g?L-1（以酒石酸計）。

1.1.2 菌株來源 ‘赤霞珠’葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)過程中分離的225個釀酒酵母單菌落。

1.1.3 商業(yè)ADY XR、FX10、FR（LAFFORT法國拉氟德公司）；BDX（ENOFERM法國萊蒙特公司）。

1.1.4 WLN營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Wallerstein Laboratory Nutrient Agar Medium） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ADY單菌落分離 取1 g商業(yè)ADY于1 mL無菌水中活化0.5 h，然后劃線接種于WLN培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)4—5 d后記錄菌落顏色和形態(tài)。每種ADY從WLN培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取10個單菌落進(jìn)行劃線純化（共計40個單菌落），然后在YPD液體培養(yǎng)基中活化24 h后，與40%的無菌甘油以1﹕1混合保藏在-80℃冰箱中備用。

1.2.2 發(fā)酵工藝 以寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的‘赤霞珠’葡萄為原料，分別進(jìn)行接種4種不同ADY葡萄酒的工業(yè)化生產(chǎn)，接種BDX、XR的發(fā)酵體積為700 L，接種FR和FX10的發(fā)酵體積為7 000 L。發(fā)酵工藝按照干紅葡萄酒工藝進(jìn)行：葡萄→手工穗選，除去成熟度不佳的果穗及雜物→除梗、破碎，添加焦亞硫酸鉀40—60 mg?L-1→入罐，添加果膠酶20—30 mg?L-1→接種商業(yè)ADY（接種量為20 g?L-1），分別于接種后的1、3和5 d取樣，5—6℃浸漬3 d→回溫→酒精發(fā)酵（發(fā)酵溫度26—28℃），每隔8 h進(jìn)行淋帽處理15 min→7—9 d酒精發(fā)酵結(jié)束→皮渣分離、壓榨。

1.2.3 發(fā)酵過程中酵母菌的分離 接種后1、3和5 d分別取樣，所取樣品為葡萄酒生產(chǎn)工藝過程中壓帽后的均勻樣品。樣品稀釋后涂布于WLN培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)5—7 d后隨機(jī)挑取20個酵母單菌落（菌落顏色乳白色至淺綠色，菌落表面光滑，呈乳頭狀凸起）進(jìn)行劃線純化，于YPD液體培養(yǎng)基中活化后保存于20%甘油中，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酵母菌的鑒定 酵母菌的DNA提取方法參考孫悅[12]的方法，釀酒酵母的鑒定參照SUN等[13]的方法。

1.2.5 Interdelta分型及聚類分析 根據(jù)所得圖譜中PCR產(chǎn)物的個數(shù)和長短來進(jìn)行不同釀酒酵母菌株的區(qū)分。本研究選用引物delta12（5′-TCAACAATG GAATCCCAAC-3′）和delta21（5′-CATCTTAACAC CGTATATGA-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。Interdelta分析的PCR體系、電泳條件及數(shù)據(jù)處理參照文獻(xiàn)[13-14]。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸80 s，循環(huán)36次；72℃保溫8 min。

1.2.6 SSR分型分析 結(jié)合前人研究[15-18]，本研究篩選位點(diǎn)多態(tài)性高及使用頻率較高的9個微衛(wèi)星位點(diǎn)，SSR分析采用的位點(diǎn)及引物信息如表1。

PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，包含10 μmol?L-1引物（表1）各1 μL，10 μmol?L-1dNTP 1 μL，10×Taq Buffer（with MgCl2）2.5 μL，5 U?μL-1Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，13 μL超純水。

表1 本研究中微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán)； 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃總延伸7 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，對結(jié)果中小數(shù)部分的處理采用四舍五入的方法。對于不同的釀酒酵母菌株而言，PCR產(chǎn)物的大小存在差異，9個位點(diǎn)會產(chǎn)生多個不同大小片段的組合，因此可以實(shí)現(xiàn)不同菌株的區(qū)分。利用PopGen32軟件統(tǒng)計微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量等[19]，在計算等位基因時，1個核苷酸的差異被認(rèn)為是相同的[20]。利用NTsys2.10e軟件計算每個菌株間的Jaccard相似性系數(shù)，用UPGMA算法構(gòu)建菌株聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 4種ADY的Interdelta指紋圖譜及SSR分析

利用Interdelta指紋圖譜技術(shù)對4種商業(yè)酵母BDX、XR、FR、FX10進(jìn)行基因分型。結(jié)果表明，分離保存的40個商業(yè)釀酒酵母單菌落（每種ADY隨機(jī)挑取10個單菌落）共顯示出6種Interdelta指紋圖譜，即6種基因型（圖1）。BDX、FX10分別由1種基因型即1種株系組成；XR和FR分別由2種基因型即2個株系組成。此外，選取9個微衛(wèi)星位點(diǎn)（表1）利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對上述4種ADY進(jìn)行分析，9個位點(diǎn)的SSR分析結(jié)果如表2所示，4種ADY顯示出4種基因型，即每種ADY各表現(xiàn)為1個株系即1種基因型。

FR1、FR2和XR1、XR2分別代表相應(yīng)ADY的不同基因型

表2 4種ADY的SSR分析結(jié)果

2.2 寧夏本土釀酒酵母的Interdelta分型及SSR分析

對分別接種BDX、XR、FR和FX10四種ADY的‘赤霞珠’葡萄酒發(fā)酵中分離的釀酒酵母進(jìn)行菌株多樣性分析，通過對接種后1、3和5 d分離的225個釀酒酵母單菌落進(jìn)行Interdelta分型，以商業(yè)酵母的Interdelta圖譜為對比，本土釀酒酵母共顯示出36種基因型，如圖2所示。根據(jù)Torija等[21]建議，以菌株數(shù)量與分析的單菌落總數(shù)的比例計算菌株變異程度，本研究中的菌株變異程度為中等16%（36/225）。接種BDX的發(fā)酵中，共分離到50個釀酒酵母單菌落，檢測到11種（α—ρ）本土基因型；接種XR的發(fā)酵中，共分離到55個釀酒酵母單菌落，檢測到6種（A—F）本土基因型；接種FR的發(fā)酵中，共分離到60個釀酒酵母單菌落，檢測到11種（aa—kk）本土基因型；接種FX10的發(fā)酵中，共分離到60個釀酒酵母單菌落，檢測到8種（a—h）本土基因型。

圖2 BDX、XR、FR和FX10四種ADY工業(yè)生產(chǎn)中分離的釀酒酵母Interdelta指紋圖譜

此外，選用9個微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行微衛(wèi)星分型，以商業(yè)酵母的SSR類型為對比，225個釀酒酵母單菌落共顯示出16種本土基因型。接種BDX的發(fā)酵中檢測到8種本土基因型（BDX-1—BDX-8）；接種XR和FX10的發(fā)酵中均檢測到1種本土基因型，分別為XR-1和FX10-1；接種FR的發(fā)酵中檢測到6種本土基因型（FR-1—FR-6）。利用PopGen軟件統(tǒng)計其遺傳多樣性相關(guān)指數(shù)，9個微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測出75個等位基因，平均每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)為8.3333個（表3）。C5位點(diǎn)上檢測到11個等位基因，C4和C11位點(diǎn)上檢測到10個等位基因，表現(xiàn)出較高的等位基因多樣性；C8位點(diǎn)檢測出5個等位基因，等位基因最少。在C11位點(diǎn)，最大等位基因和最小等位基因差值最大（144 bp）；在C8位點(diǎn)，最大等位基因和最小等位基因差值最?。?2 bp）。根據(jù)Botstein等[22]提出的PIC判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)PIC＜0.25時，該位點(diǎn)為低度多態(tài)；0.25＜PIC＜0.50時，為中度多態(tài)；當(dāng)PIC＞0.50時，為高度多態(tài)。本研究中9個位點(diǎn)的PIC為0.6339—0.8620，平均值為0.7614，都為高度多態(tài)性位點(diǎn)（表3）。9個位點(diǎn)的觀測雜合度（Ho）值為0.2000—0.5000，平均值為0.3519，期望雜合度（He）為0.6956—0.9032，平均值為0.8141，雜合度是衡量釀酒酵母群體遺傳變異情況的一個參數(shù)，雜合度越高說明群體的遺傳多樣性越高[23]，從整體來看，本研究中分離的16株寧夏本土釀酒酵母在一定程度上處于中等遺傳多樣性水平。

表3 赤霞珠葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中分離的寧夏本土釀酒酵母菌株的遺傳多樣性水平

2.3 接種發(fā)酵中ADY定殖情況分析

根據(jù)Interdelta和SSR分型結(jié)果，分析接種商業(yè)ADY發(fā)酵中釀酒酵母不同基因型的數(shù)量變化，揭示其在發(fā)酵過程中的地位，發(fā)酵過程中3個時期的各基因型數(shù)量如圖3所示。結(jié)果表明，商業(yè)ADY并沒有在各個發(fā)酵階段占據(jù)主導(dǎo)地位，對于不同的發(fā)酵階段而言，優(yōu)勢酵母的基因型也存在差異。

接種BDX的發(fā)酵中，BDX存在于整個發(fā)酵過程中，基因型γ（SSR類型為BDX-6）、BDX、基因型β（SSR類型為BDX-7）分別是1、3和5 d的主導(dǎo)菌株。接種XR發(fā)酵中，Interdelta類型XR2、A、XR1分別是1、3和5 d的主導(dǎo)菌株，均對應(yīng)SSR分析中的類型XR。Interdelta分析和SSR分析均顯示FR不是相應(yīng)發(fā)酵中的優(yōu)勢菌株，基因型bb（SSR類型為FR-2）和基因型ee（SSR類型為FR-4）是發(fā)酵中的主導(dǎo)菌株。接種FX10的發(fā)酵中，Interdelta類型基因型a、基因型b、FX10分別是1、3和5 d的主導(dǎo)菌株，均對應(yīng)SSR分析中的類型fX10。

A：接種BDX的發(fā)酵；B：接種XR的發(fā)酵；C：接種FR的發(fā)酵；D：接種FX10的發(fā)酵

2.4 釀酒酵母菌株遺傳多樣性分析

根據(jù)菌株間的Jaccard相似系數(shù)構(gòu)建4種ADY及16種本土基因型釀酒酵母菌株的聚類圖，以說明20株釀酒酵母菌株間的親緣關(guān)系（圖4）。菌株之間的Jaccard相似系數(shù)越接近1，其親緣關(guān)系越近。從聚類圖可以看出，分離自相同發(fā)酵中的釀酒酵母菌株間遺傳差異較大。

基因型FX10-1和商業(yè)酵母BDX聚在一個分支，基因型BDX-7和商業(yè)酵母FX10聚在一個分支，基因型FR-5和商業(yè)酵母XR聚在一個分支，基因型FR-6和商業(yè)酵母FR聚在一個分支，說明其親緣關(guān)系較近。如圖4所示，當(dāng)Jaccard相似系數(shù)約為0.27時，分離自接種BDX發(fā)酵中的基因型BDX-1和BDX-3的菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；當(dāng)Jaccard相似系數(shù)約為0.29時，XR、FR-2、FR-4和FR-5被聚為一類，而分離自接種XR發(fā)酵中的2種基因型XR和XR-1表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；分離自接種FR發(fā)酵中的基因型FR和FR-6聚在一個分支，其親緣關(guān)系較近；分離自接種FX10發(fā)酵中的基因型FX10、XR和FX10-1表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

圖4 商業(yè)酵母與本土釀酒酵母的UPGMA聚類圖

3 討論

本研究共分離出225個釀酒酵母單菌落，Intedelta指紋圖譜將其分為42種基因型（其中36種本土基因型），而SSR分析結(jié)果顯示出20個基因型（其中16種本土基因型），Interdelta菌株區(qū)分技術(shù)顯示出了較高的區(qū)分能力。然而，賈佳等[24]的研究表明SSR的區(qū)分能力強(qiáng)于Interdelta。Intedelta指紋圖譜法操作簡單，成本較低，其結(jié)果為多條帶圖譜，容易出現(xiàn)暗帶，給分析帶來困難。SSR分析由于進(jìn)行毛細(xì)管電泳，需合成熒光標(biāo)記引物，成本較高，其結(jié)果是擴(kuò)增片段大小的具體數(shù)值（bp），使不同實(shí)驗(yàn)室或課題組間的結(jié)果易于比較[25]。本研究中C12位點(diǎn)的觀測雜合度最高，SCAAT3位點(diǎn)雜合率最低，而張留燕等[26]的研究中，SCAAT1和YPL009C兩個位點(diǎn)雜合率高，YOR267C位點(diǎn)雜合率最低。因此，建議后續(xù)分析結(jié)合研究目的，選用合適的方法來得到滿意的結(jié)果。

研究表明，即使在接種商業(yè)酵母的情況下，仍有本土釀酒酵母的不同株系共同參與發(fā)酵過程，本土釀酒酵母甚至可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭能力主導(dǎo)發(fā)酵過程[5,7,10,27]。由于不同釀酒酵母菌株的代謝產(chǎn)物存在差異，因而對葡萄酒質(zhì)量的影響存在差異，這些本土酵母對葡萄酒質(zhì)量的貢獻(xiàn)程度有待研究。商業(yè)ADY在發(fā)酵中的定殖能力受菌株特性[1,27]、接種方式（復(fù)水活化或干粉直投）[8]和接種溫度等[7]因素影響。本研究中，商業(yè)ADY在發(fā)酵各個階段的定殖情況存在差異，由于本研究采用的原料基本理化指標(biāo)及釀酒工藝基本一致，因此產(chǎn)生這種結(jié)果的主要原因可能與不同ADY的釀酒特性有關(guān)。商業(yè)ADY在葡萄酒發(fā)酵中的主導(dǎo)地位得不到保障，ADY對葡萄酒質(zhì)量的貢獻(xiàn)及影響需進(jìn)一步研究。孫悅等[8]研究表明無論是浸漬前還是浸漬后接種，接種的ADY在各個發(fā)酵階段均具有較高的定殖能力，目標(biāo)菌株比例在90%以上。而Gil-Díaz等[1]研究發(fā)現(xiàn)，接種的ADY在整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢地位得不到保證，只有9個發(fā)酵中ADY的占比達(dá)到80%以上，而在16個發(fā)酵中接種的ADY占比低于50%。因此，對葡萄酒發(fā)酵過程中的釀酒酵母菌株多樣性進(jìn)行監(jiān)控，挖掘潛在的功能微生物，利于建立微生物與葡萄酒品質(zhì)間的聯(lián)系，促進(jìn)葡萄酒產(chǎn)品的地域特色和優(yōu)質(zhì)化生產(chǎn)。李梅花[27]的研究表明，對于接種不同釀酒酵母菌株的發(fā)酵而言，所分離到的釀酒酵母菌株多樣性差異明顯。本研究得到了類似結(jié)果，商業(yè)ADY并沒有在所有發(fā)酵階段占據(jù)主導(dǎo)地位，尤其是接種FR的發(fā)酵中，本土釀酒酵母始終占主導(dǎo)地位。本研究中，本土釀酒酵母（如Interdelta基因型中的β、基因型γ、基因型A、基因型a、基因型b、基因型bb和基因型ee）表現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭力，這些優(yōu)勢本土釀酒酵母的發(fā)酵特性有待進(jìn)一步研究，以便解釋商業(yè)酵母干粉和本土酵母之間的競爭關(guān)系。為此，后續(xù)可重點(diǎn)研究如何調(diào)控商業(yè)菌和本土菌的競爭關(guān)系，來最大限度地提升葡萄酒品質(zhì)。

通過選育本土優(yōu)良釀酒酵母進(jìn)行葡萄酒釀造，可避免葡萄酒的同質(zhì)化問題，生產(chǎn)具有地域特色的葡萄酒[28-32]。本研究中，某些本土酵母在發(fā)酵中的定殖能力強(qiáng)于商業(yè)活性干酵母，這些優(yōu)勢本土釀酒酵母的工藝性狀和香氣分析有待進(jìn)一步研究，以利用這些酵母菌生產(chǎn)凸顯產(chǎn)區(qū)特色的葡萄酒。

4 結(jié)論

葡萄酒生產(chǎn)中使用的某些ADY由2種以上株系構(gòu)成，且不同菌株在‘赤霞珠’葡萄酒發(fā)酵中的數(shù)量差異較大。接種商業(yè)ADY的葡萄酒發(fā)酵中，本土釀酒酵母基因型豐富，發(fā)酵是由本土酵母與商業(yè)酵母共同參與完成的，且二者在發(fā)酵過程中相互競爭，數(shù)量動態(tài)演替。

[1] GIL-DíAZ M, VALERO E, CABALLOS J M, GARCIA M, ARROYO T. The impact of active dry yeasts in commercial wineries from the denomination of origen “Vinos de Madrid”, Spain3 Biotech2019, 9(11): 382. doi: 10.1007/s13205-019-1913-3.

[2] BARRAJóN N, ARéVALO-VILLENA M, RODRíGUEZ-ARAGóN L J, BRIONES A. Ecological study of wine yeast in inoculated vats from La Mancha region. Food Control, 2009, 20(9): 778-783.

[3] CORDEROBUESO G, RODRíGUEZ M E, GARRIDO C, CANTORAL JM. Rapid and not culture-dependent assay based on multiplex PCR-SSR analysis for monitoring inoculated yeast strains in industrial wine fermentations. Archives of Microbiology, 2017, 199(1): 135-143.

[4] DE CELIS M, RUIZ J, MARTíN-SANTAMARíA M, MARíA, ALONSN A, MARQUINA D, NAVASCUéS E, GOMEZ-FLECHOSO M A, BELDA I, SANTOS A. Diversity ofyeasts associated to spontaneous and inoculated fermenting grapes from Spanish vineyards. Letters in Applied Microbiology, 2019, 68(6). doi: 10.1111/lam.13155.

[5] VIGENTINI I, FABRIZIO V, FACCINCANI M, PICOZZI C, COMASIO A, FOSCHINO R. Dynamics ofpopulations in controlled and spontaneous fermentations for Franciacorta D.O.C.G. base wine production. Annals of Microbiology, 2014, 64: 639-651.

[6] LANGE J N, FAASSE E, TANTIKACHORNKIAT M, GUSTAFSSON F S, HALVORSEN L C, KLUFTINGER A, LEDDERHOF D, DURALL D M. Implantation and persistence of yeast inoculum in pinot noir fermentations at three Canadian wineries. International Journal of Food Microbiology, 2014, 180: 56-61.

[7] MATURANO Y P, LERENA M C, MESTRE M V, CASASSA L F, TORO M E, VAZQUEZ F, MERCADO L, COMBINA M. Inoculation strategies to improve persistence and implantation of commercialstrains in red wines produced with prefermentative cold soak. LWT-Food Science and Technology, 2018, 97: 648-655.

[8] 孫悅, 葉冬青, 褚越, 張怡飛, 劉延琳. 不同接種方式及溫度對活性干酵母發(fā)酵的影響. 釀酒科技, 2019(3): 24-28, 37.

SUN Y, YE D Q, CHU Y, ZHANG Y F, LIU Y L. Effects of different inoculation methods & temperatures on fermentation of active dry yeast. Brewing Technology, 2019(3): 24-28, 37. (in Chinese)

[9] 何娟, 曹培鑫, 黃英子, 劉延琳. 貴人香冰酒大生產(chǎn)過程中酵母菌群結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化. 中國釀造, 2014, 33(5): 30-33.

HE J, CAO P X, HUANG Y Z, LIU Y L. Dynamics of wine related yeasts during industrial icewine fermentations of Italian Riesling. Brewed in China, 2014, 33(5): 30-33. (in Chinese)

[10] 宋育陽, 裴穎芳, 王國平, 劉延琳. 黑比諾葡萄接種發(fā)酵過程酵母菌的變化監(jiān)控. 中國食品學(xué)報, 2010, 10(2): 125-130.

SONG Y Y, PEI Y F, WANG GP, Liu Y L. Monitoring of yeast changes during inoculated fermentation process of Pinot Noir grape. Chinese Journal of Food Science, 2010,10(2): 125-130. (in Chinese)

[11] 劉松濤, 李茜, 呂雯, 秦萍. 中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢—以寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)為例. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2019(9): 241-243.

LIU S T, LI Q, Lü W, QIN P. Present situation and development trend of Chinese wine industry:A case study of producing area at Eastern Foot of Helan Mountain in Ningxia. Modern Agricultural Science and Technology, 2019(9): 241-243. (in Chinese)

[12] 孫悅. 不同氮素水平對釀酒酵母混合發(fā)酵特征的影響及其代謝物研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016.

SUN Y. Effects of different nitrogen levels on the characteristics and metabolites ofduringmixedfermentation. [D]. Yangling: Northwest A & F University, 2016. (in Chinese)

[13] SUN Y, QIN Y, PEI Y F, WANG G P,JOSEPH C M, BISSON L, LINDA F, LIU Y L. Evaluation of Chinesewine strains from different geographical origins. American Journal of Enology and Viticulture, 2017, 68: 73-80.

[14] 孫悅, 張方方, 褚遂興, 李佳幸, 邵帥, 張軍翔. 接種不同嗜殺特性的釀酒酵母對赤霞珠發(fā)酵中酵母多樣性的影響. 食品科學(xué), 2020, 41(2): 166-172

SUN Y, ZHANG F F, CHU S X, LI J X, SHAO S, ZHANG J X. Effects ofstrains with different killer activity on the yeast diversity in inoculated fermentation of Cabernet Sauvignon. Food Science, 2020, 41(2): 166-172. (in Chinese)

[15] LEGRAS J L, RUH O, MERDINOGLU D, KARST F. Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization ofstrains. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102(1): 73-83.

[16] JUBANY S, TOMASCO I, DE LEO′N I P, MEDINA K, CARRAU F, ARRAMBIDE N, NAYA H, GAGGERO C. Toward a global database for the molecular typing ofstrains. FEMS Yeast Research, 2008, 8: 472-484.

[17] HALL B, DURALL D M, STANLEY G. Population dynamics ofduring spontaneous fermentation at a British Columbia Winery. American Journal of Enology and Viticulture,2011, 62(1): 66-72.

[18] STEFANINI I, ALBANESE D, SORDO M, LEGRAS J L, DE FILIPPO C, CAVALIERI D, DONATI C.IDentifier, SID: Strain-level analysis ofpopulations by using microsatellite meta-patterns. Scientific Reports, 2017, 7: 15343.

[19] 蔣文鴻, 嚴(yán)斌, 陶永勝. 昌黎赤霞珠葡萄相關(guān)釀酒酵母的分離與篩選. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(12): 202-206, 209.

JIANG W H, YAN B, TAO Y S. Isolation and screening offrom grape harvested in Changli.Food Industry Technology, 2014, 35(12): 202-206, 209.(in Chinese)

[20] RICHARDS K D, GODDARD MATTHEW R, GARDNER RICHARD C. A database of microsatellite genotypes for. Antonie van Leeuwenhoek, 2009, 96(3): 355-359.

[21] TORIJA M J, ROZEèS N, POBLET M, GUILLAMóN J, MAS A. Yeast population dynamics in spontaneous fermentations: Comparison between two different wine-producing areas over a period of three years. Antonie van Leeuwenhoek, 2001, 79: 345-352.

[22] BOTSTEIN D, WHITE R L, SKOLNICK M, DAVIS R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 314-331

[23] 楊寬, 毛如志, 趙悅, 何遲, 王慧玲, 曹建宏, 速偉, 何霞紅. 云南香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒相關(guān)酵母菌的生物多樣性. 微生物學(xué)通報, 2018, 45(12): 2708-2721.

YANGK, MAO R Z, ZHAO Y, HEC, WANG H L, CAO J H, SU W, HE X H. Biodiversity of wine-related yeasts isolated from Shangri-La wine-producing region of Yunnan. Bulletin of Microbiology, 2018, 45(12): 2708-2721. (in Chinese)

[24] 賈佳, 王冠群, 朱麗霞, 韓培杰, 郭東起, 陳明. 新疆葡萄和葡萄酒相關(guān)釀酒酵母種群的結(jié)構(gòu)特征. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2018, 37(2): 94-99.

JIA J, WANG G Q, ZHU L X, HAN P J, GUO D Q, CHEN M. Structure characteristics ofpopulation associated with grape and wine in Xinjiang. Journal of Dalian Polytechnic University, 2018, 37(2): 94-99. (in Chinese)

[25] 馮敏, 王春曉, 劉延琳. 利用微衛(wèi)星多態(tài)性揭示釀酒酵母菌株遺傳多樣性. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(12): 2537-2543.

FENG M, WANG C X, LIU Y L. Genetic diversity ofstrains revealed by Microsatellite sequence polymorphism.Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(12): 2537-2543. (in Chinese)

[26] 張留燕, 黃英子, 劉延琳. 利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析釀酒酵母的遺傳多樣性. 食品科學(xué), 2014, 35(1):130-133.

ZHANG L Y, HUANG Y Z, LIU Y L. Genetic diversity analysis ofstrains by Microsatellite marker technique. Food Science, 2014, 35(1): 130-133. (in Chinese)

[27] 李梅花. 復(fù)合酵母在赤霞珠發(fā)酵過程中酵母菌相互作用研究. 釀酒科技, 2016(11): 60-64.

LI M H. Interactions of yeast strains in the fermentation process of Cabernet Sauvignon. Brewing Technology, 2016(11): 60-64. (in Chinese)

[28] 苑偉. 優(yōu)選釀酒酵母菌株釀酒特性的比較研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2010: 4-7.

YUAN W. Comparative study ofthevinification characteristic ofselectedwineyeast[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2010: 4-7. (in Chinese)

[29] 李雙石, 李浡, 李文蕾, 吳志明, 蘇寧. 天然酵母菌株在葡萄酒釀造中的應(yīng)用研究. 食品科技, 2012, 37(8): 87-91.

LI S S, LI S, LI W L, WU Z M, SU N. Application of indigenous yeast strain in the wine making. Food Science and Technology, 2012, 37(8): 87-91. (inChinese)

[30] ORTIZ M J, BARRAJóN N, BAFFI M A, MARIA AV, BRIONES A. Spontaneous must fermentation: Identification and biotechnological properties of wine yeasts. LWT-Food Science and Technology, 2013, 50(2): 371-377.

[31] ?URANSKá H, VRáNOVá D, OMELKOVá J. Isolation, identification and characterization of regional indigenousstrains. Brazilian Journal of Microbiology, 2016, 47(1): 181-190.

[32] GAROFALO C, BERBEGAL C, GRIECO F, MARIA T, GIUSEPPE S, VITTORIO C. Selection of indigenous yeast strains for the production of sparkling wines from native Apulian grape varieties. International Journal of Food Microbiology, 2018, 285: 7-17.

Implantation and Persistence of Inoculated Active Dry Yeast in Industrial Wine Fermentations

1School of Food and Wine, Ningxia University, Yinchuan 750021;2College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi

【】The purpose of this study was explore the implantation and persistence of commercial active dry yeast (ADY) during industrial wine fermentations, and their competitive relationship between Chinese indigenousduring fermentation process, so as to provide the theoretical basis for the breeding of indigenousand provide the reference for the use of ADY in wine production.【】Industrial wine fermentations were carried out at wineries in Eastern Foot of Helan Mountain in Ningxia. Four vats of Cabernet Sauvignon gape must were inoculated with BDX, XR, FR and FX10, respectively. Samples were collected and analyzed at 1 d, 3 d and 5 d after the inoculation. Interdelta and SSR analysis were used to investigate the genotypes of differentstrains. Therefore, the number and proportion ofstrains in different fermentation stages were analyzed, and the colonization ability of commercial ADY was tracked. Genetic diversity parameters were calculated by PopGen32 software. The genetic correlation between commercial yeast and Ningxia indigenous yeast was revealed by NTsys2.10e software.【】Interdelta fingerprint showed 6 kinds of fingerprints, namely 6 genotypes. And XR and FR showed more than one genotype; BDX and FX10 showed one genotype, respectively. SSR analysis showed that there was one genotype in each ADY for the 9 locus. 225isolates were isolated from the 4 inoculated fermentations. Interdelta fingerprint showed 42 genotypes, of which 36 genotypes were indigenous strains. The degree of variability (16%, 42/225) was intermediate. SSR analysis showed 20 genotypes, of which 16 genotypes were indigenous strains. The analyzed 9 microsatellite prime pairs generated a total of 75 polymorphic bands, 8.3333 alleles for per locus. The heterozygosity observed was 0.2000-0.5000. The polymorphism information contents (PIC) of all strains at 9 loci were 0.6339-0.8620, suggesting that the 9 SSR loci were hypervariable. The indigenous genotypes were the most abundant in the fermentation inoculated with BDX (11 Interdelta types and 8 SSR types), followed by FR (11 Interdelta types and 6 SSR types). ADY did not dominate all three stages. Moreover, the genotypes of the dominant strains were also different for different stages in the same fermentation. Interdelta and SSR analysis showed FR was not dominant in the corresponding fermentation. Although BDX existed in the whole fermentation process, it was only dominant at d 3 after the inoculation. In the fermentation inoculated with XR and FX10, Interdelta analysis showed that they were not the dominant strains, while SSR analysis showed that they were the dominant strains in the corresponding fermentations, respectively. Indigenous strains of genotype β (SSR genotype BDX-7), genotype γ (SSR genotype BDX-6), genotype A (SSR genotype XR), genotype a (SSR genotype FX10), genotype b (SSR genotype FX10), genotype bb (SSR genotype FR-2) and genotype ee (SSR genotype FR-4) showed strong competitiveness in the corresponding fermentations. Cluster analysis showed that the genetic diversity among thestrains isolated from the same fermentation was large.【】The genotypes of indigenousstrains in the industrial wine fermentations were rich. The inoculated fermentations were completed by both indigenous strains and commercial ADY, and they competed with each other in the same fermentations and showed dynamic succession of different strains.

ADY; inoculated fermentation; strain typing; wine; SSR

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.016

2020-08-24；

2020-11-30

國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（31960473）、寧夏賀蘭山東麓葡萄酒風(fēng)格固化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范（2020BCF01003）、寧夏大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目、西夏區(qū)科技發(fā)展計劃

孫悅，E-mail：yuesun86@126.com。通信作者張軍翔，E-mail：zhangjunxiang@126.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）