長江下游粳稻稻瘟病廣譜抗性基因組合模式分析

吳云雨，肖寧,4，余玲，蔡躍，潘存紅，李育紅，張小祥，黃年生，季紅娟，戴正元，李愛宏,3

長江下游粳稻稻瘟病廣譜抗性基因組合模式分析

吳云雨1,2，肖寧1,2,4，余玲1,2，蔡躍1,2，潘存紅1,3，李育紅1,2，張小祥1,2，黃年生1,2，季紅娟1,2，戴正元1,3，李愛宏1,2,3

1江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚州 225007；2揚州大學(xué)江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室，江蘇揚州 225009；3揚州大學(xué)江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193

【】基因聚合是實現(xiàn)水稻稻瘟病廣譜抗性的有效途徑之一。通過構(gòu)建粳稻背景下不同雙基因聚合系，利用長江下游粳型稻瘟病菌（）菌株評價其抗性效應(yīng)并解析其抗性效應(yīng)產(chǎn)生的構(gòu)成因子，為長江下游粳稻抗稻瘟病育種提供廣譜抗性基因組合模式和種質(zhì)資源。以粳稻07GY31為背景的Piz基因座不同復(fù)等位基因（、、、、和）單基因系為核心，利用不完全NCII交配設(shè)計，分別與其他廣譜抗性基因（、和）單基因系雜交，經(jīng)分子標記輔助選擇和農(nóng)藝性狀篩選，共構(gòu)建18種不同基因組合的雙基因聚合系。2019年利用長江下游粳稻種植區(qū)采集、分離的109個稻瘟病代表性菌株進行苗瘟、穗瘟人工接種鑒定及不同病圃的自然誘發(fā)鑒定，評價不同雙基因聚合系的抗性效應(yīng)，并分析雙基因聚合系抗性效應(yīng)的構(gòu)成因子。genotyping by sequencing（GBS）分析表明所構(gòu)建的雙基因聚合系均具有較高的背景恢復(fù)率，分布于97.08%（PPL）—99.08%（PPL）。表明除了目標基因區(qū)域不同外，所有雙基因聚合系的遺傳背景幾乎完全與受體親本07GY31一致。同時人工接菌鑒定表明絕大部分雙基因聚合系苗瘟和穗瘟抗性水平都優(yōu)于單基因系。其中苗瘟抗性效應(yīng)較好的聚合系分別為PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL, 而穗瘟抗性效應(yīng)較好的聚合系分別為PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL。不同抗性基因聚合后產(chǎn)生不同的效應(yīng)，其中互補效應(yīng)高且能有效表達是提高雙基因聚合系苗瘟和穗瘟抗性的關(guān)鍵因子。雙基因聚合系PPL、PPL和PPL在苗瘟和穗瘟的人工接種，以及在不同病圃的自然誘發(fā)鑒定中均表現(xiàn)穩(wěn)定的廣譜抗性，同時，農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果也表明這3個雙基因聚合系的基本農(nóng)藝性狀與輪回親本07GY31基本一致，因此，基因組合/、/和/是適于長江下游粳稻的廣譜抗性基因組合模式?？剐曰虻慕M合方式影響聚合系的抗性水平，互補效應(yīng)高且能有效表達是粳型雙基因聚合系抗性效應(yīng)提高的關(guān)鍵因子。本研究構(gòu)建的雙基因聚合系及其抗性效應(yīng)分析為長江下游廣譜稻瘟病抗性粳稻品種的精準培育提供了種質(zhì)資源和理論支撐。

長江下游；粳稻；稻瘟病菌；稻瘟?。换蚓酆?；效應(yīng)分析

0 引言

【研究意義】由稻瘟病菌（）引起的稻瘟病是威脅世界水稻安全生產(chǎn)的主要真菌類病害之一[1]，控制該病害最為經(jīng)濟有效、綠色安全的策略是利用抗病基因培育抗病品種[2]，但目前已鑒定的絕大多數(shù)稻瘟病抗性基因為垂直抗性基因，其中部分抗性基因存在不能兼顧苗瘟和穗瘟抗性、抗譜窄等缺點，同時由于稻瘟病菌的致病性分化快、生理小種多、變異頻繁，導(dǎo)致抗病品種應(yīng)用3—5年后便“喪失”抗性變?yōu)楦胁∑贩N?？剐曰蚓酆媳蛔C明是培育廣譜抗病品種的主要途徑之一[3-4]，然而，不同的抗性基因聚合后會產(chǎn)生不同的抗性效應(yīng)。因此，合理利用不同抗性基因進行聚合并評價其抗性效應(yīng)，進而發(fā)掘有效的廣譜抗性基因組合模式對培育廣譜抗病品種、保障水稻安全生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實意義和實踐應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M展】宿主對病原菌的抗性反應(yīng)可分為完全抗性和部分抗性兩種類型，完全抗性通常由單個主效抗病基因控制，而部分抗性通常由多個微效抗性基因控制[5-6]。水稻稻瘟病主效抗病基因大多為來自STAND（signal transduction ATPases with numerous domains）亞家族中的NBS-LRR蛋白家族成員[7]，NBS-LRR蛋白以直接或間接方式識別病原菌無毒蛋白后激活下游基因表達從而激發(fā)水稻抗病免疫反應(yīng)[8-11]。目前，已鑒定的稻瘟病主效抗性基因超過100個，部分抗性基因約347個[12-13]。其中有28個主效抗性基因（、、、、、、、、、、、、、、、/、/、、/、、、、、和）[14-16]及5個部分抗性基因（、、、和）[17-21]被成功克隆，為稻瘟病抗性育種提供了有效基因資源，但由于稻瘟病菌群體的高度變異及新的毒性種群的出現(xiàn)，許多攜帶單一抗病基因（、、和）的抗性品種在大規(guī)模種植一段時間后失去了抗性效應(yīng)變?yōu)楦胁∑贩N[22-24]。為降低抗性喪失風(fēng)險，利用不同抗病基因進行基因聚合是培育廣譜、持久抗病品種的一個有效途徑。Jiang等[25]和Xiao等[26]分別報道聚合//和/的改良系對中國南方稻區(qū)稻瘟病菌菌株具有廣譜抗性，而聚合則對印度稻瘟病菌群體表現(xiàn)出廣譜抗性[4]。但抗病基因聚合后并不簡單表現(xiàn)出抗性效應(yīng)累加，有的還存在正向甚至負向互作。國際水稻研究所以Co39為背景構(gòu)建攜帶不同抗性基因的聚合系，鑒定結(jié)果顯示Piz/的基因聚合系抗性不如單基因抗性品系[27]。同樣，Xiao等[28]研究發(fā)現(xiàn)在粳稻07GY31背景下雙基因聚合系穗瘟抗性顯著低于單基因系；Wu等[29]以秈稻揚稻6號為背景，構(gòu)建了15種不同的抗性基因聚合系，發(fā)現(xiàn)/、/和/為秈稻背景下的廣譜抗性基因組合模式，同時也發(fā)現(xiàn)部分基因組合產(chǎn)生了負向互作效應(yīng)。此外，由于稻瘟病菌生理小種依賴于水稻宿主生存，生理小種基因型分布與水稻宿主種植區(qū)域有關(guān)，來自秈稻、粳稻種植區(qū)域的生理小種被明顯分為“秈稻群”和“粳稻群”[30-31]。因此，在不同種植區(qū)需選擇與當(dāng)?shù)氐疚敛【悍怯H和性的抗性基因進行基因聚合，確保基因聚合后可有效提高其抗性水平。【本研究切入點】長江下游地區(qū)為我國主要粳稻種植區(qū)之一，約占全國粳稻總種植面積的40%[32-33]，該地區(qū)粳稻主要含有、、、和等抗性基因[34-35]。近年來，隨著耕作制度和氣候條件的變化，稻瘟病在長江下游粳稻種植區(qū)常態(tài)化發(fā)生。如2014年江蘇水稻稻瘟病發(fā)生面積98萬公頃，2016年上升至128.7萬公頃，且發(fā)病面積呈逐年增加趨勢，水稻生產(chǎn)存在嚴重安全隱患。表明長江下游應(yīng)用品種現(xiàn)有攜帶的抗性基因已遠不能控制稻瘟病的發(fā)生，亟需導(dǎo)入新的抗性基因/基因組合?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以粳稻07GY31為背景的Piz基因座不同復(fù)等位基因（、、、、和）單基因系為核心，采用不完全NCII交配設(shè)計，分別與其他廣譜抗性基因（、和）單基因系雜交，經(jīng)過分子標記輔助選擇和農(nóng)藝性狀篩選，構(gòu)建18種不同基因組合的雙基因聚合系。從長江下游不同粳稻種植區(qū)采集稻瘟病菌菌株進行苗瘟和穗瘟的人工接種鑒定，以及開展病圃的自然誘發(fā)鑒定，評價不同雙基因聚合系的抗性效應(yīng)，并分析雙基因聚合系抗性效應(yīng)的構(gòu)成因子，從而明確適宜長江下游粳稻的稻瘟病廣譜抗性基因組合模式，以期為該地區(qū)粳稻抗稻瘟病育種提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料及菌株

輪回親本07GY31由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所育成，該品系農(nóng)藝性狀優(yōu)良，但高感稻瘟病。NIL、NIL、NIL、NIL、NIL、NIL、NIL、NIL和NIL9個廣譜抗性基因近等基因系均以07GY31為輪回親本構(gòu)建而成[36]。

2013—2019年分別從江蘇、安徽、浙江、江西、湖北等長江下游粳稻種植區(qū)采集并分離109個稻瘟病菌菌株應(yīng)用于本研究。稻瘟病菌的單孢分離、菌株培養(yǎng)及菌液制備按照Puri等[37]報道的方法進行。

1.2 分子標記檢測

1.2.1 基于分子標記的前景選擇 在雙基因聚合系構(gòu)建過程中，采用簡易TPS快速提取法提取水稻基因組DNA[38]。利用表1所示引物進行基因擴增，以便對各目標基因進行前景選擇。20 μL PCR反應(yīng)體系含MgCl2（25 mmol·L-1）2.0 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，引物（上下游引物，10 μmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.4 μL，DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，模板DNA 2.0 μL；ddH2O 11.9 μL。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s；55—58℃（視不同引物而定）退火45 s；72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)，最后72℃充分延伸10 min。根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小，分別采用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠及4%瓊脂糖凝膠電泳對目標擴增產(chǎn)物進行電泳分離。

1.2.2 基于genotyping by sequencing（GBS）的背景分析 利用DNAsecure Plant kit試劑盒（Qiagen，USA）提取所有試驗材料的基因組DNA。利用BioPhotometer plus核酸測定儀（Eppendorf，Germany）檢測核酸濃度及質(zhì)量。高質(zhì)量的DNA用于GBS文庫構(gòu)建和測序，首先應(yīng)用限制性內(nèi)切酶H I和I對基因組DNA進行酶切，酶切后的片段參考Poland等[39]方法進行建庫并用第二代測序儀Illumina HiSeq 2000 Sequencer（Illumina，USA）進行雙末端（pair end）測序。測序深度為~10×coverage，去除原始測序序列中的接頭序列和低質(zhì)量的短讀序列，剩下的高質(zhì)量序列采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）程序?qū)⑵淦ヅ涞饺毡厩鐓⒖蓟蚪M上[40]。利用GATK（V4.1）軟件[41]提取SNP，每個聚合系以輪回親本對照，利用Tassel（V5.0）去除聚合系與輪回親本間相同的SNP，不同SNP在染色體上的密度做圖參照R語言包（Cmplot V3.6.0），隨機選擇3萬個SNP標記用于背景恢復(fù)率的計算，背景恢復(fù)率=（相同標記數(shù)/總標記數(shù)）×100%。

表1 用于檢測目的基因的分子標記詳細信息

1.3 抗性鑒定

1.3.1 人工接種鑒定 2019年5月在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所萬?；夭捎?09個稻瘟病菌菌株對9個單基因系、18個雙基因聚合系進行苗瘟抗性鑒定。供試水稻材料播種于塑料盆中，加入營養(yǎng)土于人工氣候室中育苗（27—30℃，正常光照）。所有供試水稻材料都隨機設(shè)置3個重復(fù)，并以輪回親本07GY31及普感品種LTH作為陰性對照。待秧苗長至3—4葉期時移至玻璃接種箱內(nèi)。將孢子懸浮液配制成濃度為5×104個/ml，并加入0.02% Tween-20作為表面活性劑。用連接空氣壓縮機的噴槍在接種箱內(nèi)噴霧接種，每個秧盤內(nèi)接種40—50 ml的孢子懸浮液。26℃黑暗保濕24 h，然后轉(zhuǎn)移至可控溫室內(nèi)，在溫度為26—28℃、相對濕度＞95%的溫濕環(huán)境下生長。7—10 d后調(diào)查、記載各家系植株葉片上的病斑數(shù)目及反應(yīng)類型，病情調(diào)查按Mackill等[42]分級標準進行。

2019年正季在自然條件下，采用人工注射接種法對以上材料進行穗瘟抗性鑒定。參考Wu等[43]的選擇標準，從109個稻瘟病菌菌株中挑選出28個代表性菌株用于穗瘟接種鑒定。每個試驗材料種植成120株的小區(qū)，每區(qū)10行，每行12株，株行距13.3 cm×25 cm，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計（RCBD），每個試驗材料重復(fù)種植兩次，常規(guī)水肥管理。8月初選擇孕穗期劍葉葉枕與倒二葉距離為3—4 cm左右的穗苞進行接種，每個菌株接種每個株系10穗，每穗注射1 mL，孢子接種濃度為5×104個/ml，并對接種后的稻穗作好標記。接種21 d后調(diào)查發(fā)病情況，穗瘟鑒定評價參照Wu等[36]標準?？剐灶l率（resistance frequency，RF）=（接種后表現(xiàn)抗的菌株數(shù)/接種總菌株數(shù)）×100%。

1.3.2 病圃的多點自然誘發(fā)鑒定 2019年正季將以上單基因系及雙基因聚合系分別種植于江蘇金壇、安徽廬江和浙江長興的常年稻瘟病重發(fā)區(qū)。每個試驗材料栽10行，每行10株，株行距13.3 cm×25 cm，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計（RCBD），每個試驗材料重復(fù)種植3次。為了使每個鑒定材料都能與誘發(fā)品種接觸，每隔兩個鑒定小區(qū)的材料播一行感病誘發(fā)品種。病圃水層保持10 cm，進行田間自然誘發(fā)。試驗田不使用任何殺菌劑，其他按常規(guī)肥水管理。齊穗30 d后調(diào)查每個鑒定材料的穗發(fā)病情況。調(diào)查、評價方法參照Wu等[29]，健康稻穗率（health panicle proportion，HPP）=（小區(qū)未感染稻瘟病穗數(shù)/小區(qū)總穗數(shù)）×100%。

1.4 基本農(nóng)藝性狀調(diào)查

除用于接種鑒定外，各株系材料同時種植一份用于農(nóng)藝性狀調(diào)查。5月18日播種，6月13日進行移栽，單本栽插，每區(qū)10行，每行12株，株行距13.3 cm×25 cm，常規(guī)水肥管理。適期取每株系中間第2—9行之間的5株材料進行抽穗期、株高、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、單株產(chǎn)量等基本農(nóng)藝性狀的調(diào)查。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理和表格繪制，多重比較采用IBM SPSS Statistics 22進行數(shù)據(jù)分析，雙基因聚合系抗性效應(yīng)的構(gòu)成因子分析的?；鶊D及雙基因聚合系在不同病圃抗性表現(xiàn)的三維散點圖均使用Python語言包（v 3.7.7）進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的雙基因聚合系具有較高的背景恢復(fù)率

雙基因聚合系構(gòu)建方法參考Wu等[29]的方法，采用不完全雙列雜交法（NCII）配制18個雜交F1組合，針對每個組合，開展目標基因的特異性標記檢測，篩選目標雙基因均為雜合帶型的F1單株進行自交，獲得1 000個左右F2單株的群體。結(jié)合標記輔助選擇和農(nóng)藝性狀篩選，在不同F(xiàn)2群體中分別篩選出4—22個目標雙基因純合且基本農(nóng)藝性狀類似輪回親本07GY31的雙基因聚合單株，將這些單株加代到F3種植成株系。進一步選擇2—4個農(nóng)藝性狀與07GY31基本一致的F3株系，通過GBS分析進行背景回復(fù)率檢測。選擇背景恢復(fù)率最高的一個株系用于后續(xù)的抗性鑒定評價。GBS分析結(jié)果表明不同雙基因聚合系均具有較高的背景恢復(fù)率，普遍在97.00%以上，分布于97.08%（PPL）—99.08%（PPL）（圖1）。表明除了目標基因區(qū)域不同外，所有雙基因聚合系的遺傳背景幾乎完全與受體親本07GY31一致。

2.2 雙基因聚合系抗性水平普遍優(yōu)于單基因系

利用采集到的稻瘟病菌菌株對9個單基因系、18個雙基因聚合系及輪回親本分別在苗期及抽穗期進行人工接種鑒定，結(jié)果表明不同抗性基因聚合后，其苗瘟及穗瘟的抗性水平顯著高于單基因系（圖2-A、2-B）。就苗瘟抗性而言，不同基因聚合后產(chǎn)生了不同的聚合效應(yīng)，導(dǎo)致不同聚合系之間的抗性水平存在顯著差異（圖2-C）。根據(jù)抗性水平的不同，可將不同聚合系劃分為兩個抗性等級，第一級為PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL9個雙基因聚合系，抗性頻率在88.99%—99.08%；第二級則為以PPL為代表的另外9個雙基因聚合系，抗性頻率分布在28.44%—73.39%。針對高抗性水平基因而言，盡管NIL的抗性頻率高達94.50%，但是與和聚合后其抗性頻率均提高了4.58%。對于低抗性水平基因而言，其單基因系的抗性頻率為27.52%，與、和聚合后其抗性頻率則分別提高了20.19%、13.76%和0.92%。

針對穗瘟而言，不同基因聚合后同樣產(chǎn)生不同聚合效應(yīng)，導(dǎo)致不同聚合系間抗性水平存在顯著差異（圖2-D）?？傮w而言，穗瘟的抗性頻率普遍要低于苗瘟。根據(jù)抗性水平的不同，同樣將聚合系抗性水平劃分為兩個等級，第一級為PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL、PPL7個雙基因聚合系，抗性頻率在64.29%—85.71%。第二級則為以PPL為代表的11個雙基因聚合系，抗性頻率分布在21.43%—50.00%。盡管NIL的穗瘟抗性頻率為82.14%，但是與和聚合后其抗性頻率均提高了3.57%。值得注意的是，單基因系抗性頻率僅為35.71%，與（RF=28.57%）聚合后，其雙基因聚合系PPL的抗性頻率達到64.29%；而與（RF=39.29%）和（RF=35.71%）聚合后，其雙基因聚合系PPL和PPL的抗性頻率同樣達到46.43%，相對NIL的抗性水平得到顯著提高。由此可見，對于部分抗性效應(yīng)不好的單基因，選擇合適的基因組合方式，可達到顯著提高抗性水平的目的。

2.3 互補效應(yīng)為提升雙基因聚合系抗性水平的關(guān)鍵因子

為進一步分析聚合系抗性提高的原因，將聚合系對稻瘟病菌菌株的抗性效應(yīng)歸為重疊效應(yīng)、互補效應(yīng)和互作效應(yīng)3種類型。分析各效應(yīng)與苗瘟及穗瘟的抗性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)重疊效應(yīng)和互補效應(yīng)與聚合系的抗性顯著相關(guān)，其中互補效應(yīng)及其能否有效表達是影響聚合系抗性水平的關(guān)鍵因子。在苗瘟抗性中，具有較高抗性頻率的第一級的9個聚合系均有較高的互補效應(yīng)，其平均互補效應(yīng)為50.87%，并且46.48%的互補效應(yīng)能有效表達（即聚合的兩個目的基因一方為抗病表型，可以互補另一方的感病表型，導(dǎo)致聚合系為抗病表型），提高了聚合系的抗性效應(yīng)，只有4.39%的互補效應(yīng)不能有效表達（即聚合的兩個目的基因一方為抗病表型不能互補另一方的感病表型，導(dǎo)致聚合系為感病表型），降低了聚合系的抗性效應(yīng)。而在以PPL為代表的抗性頻率較低的第二級的另外9個聚合系中，其平均互補效應(yīng)為43.94%，且只有27.32%的互補效應(yīng)得到有效表達，提高了聚合系的抗性效應(yīng)，而有16.62%的互補效應(yīng)不能有效表達，導(dǎo)致聚合系出現(xiàn)感病表型（圖3-A）。同樣地，在穗瘟抗性反應(yīng)中，具有較高抗性頻率的第一級的7個聚合系均有較高的互補效應(yīng)，其平均互補效應(yīng)為50.00%，且有39.80%互補效應(yīng)提高了聚合系的抗性效應(yīng)，如穗瘟抗性表現(xiàn)最好的PPL、PPL和 PPL的互補效應(yīng)分別為46.43%、57.14%和60.71%。而以PPL為代表的抗性頻率較低的第二級的另外11個聚合系中，其平均互補效應(yīng)為43.08%，且僅有22.64%的互補效應(yīng)得以有效表達，提高了聚合系的抗性水平，而有20.44%的互補效應(yīng)不能表達，從而降低了聚合系的抗性效應(yīng)?？剐孕?yīng)最低的PPL和PPL其互補效應(yīng)均僅為32.14%，且均只有14.28%的互補效應(yīng)提高了聚合系的抗性效應(yīng)（圖3-B）。此外，所有基因組合中都存在一定的正向互作效應(yīng)（即聚合的兩個目的基因雙方都為感病表型，聚合后表現(xiàn)為抗病表型），導(dǎo)致基因聚合后抗性效應(yīng)得到進一步的提高，如單基因系穗瘟抗性頻率僅為35.71%，與聚合后，分別產(chǎn)生了10.72%的重疊效應(yīng)，25.00%的互補效應(yīng)及28.57%的互作效應(yīng)，導(dǎo)致其雙基因聚合系PPL的穗瘟抗性頻率達到了64.29%。因此，抗病基因的組合方式直接決定了聚合系的抗性水平，選擇互補效應(yīng)高且能有效表達的抗病基因組合模式對培育廣譜抗性品種具有重要作用。

圓圈代表R基因所在的基因座位置The circle represents the locus of the R gene

A、B：雙基因聚合系、單基因系和輪回親本間苗瘟和穗瘟的綜合比較分析Comprehensive comparative analysis on seedling blast and panicle blast RF of PPLs, NILs and the recurrent parent；C、D：雙基因聚合系、單基因系和輪回親本的苗瘟、穗瘟抗性表現(xiàn)Resistance performances of PPLs, NILs and the recurrent parent for seedling blast and panicle blast resistance

2.4 含有Pigm的基因組合在不同病圃間抗性表現(xiàn)最為穩(wěn)定

為進一步明確不同聚合系在自然種植、病原菌強脅迫條件下的發(fā)病情況，各聚合材料及輪回親本07GY31分別種植于江蘇金壇、安徽廬江和浙江長興3個稻瘟病重發(fā)區(qū)，進行田間自然誘發(fā)鑒定。結(jié)果顯示，輪回親本07GY31在這3個地區(qū)均屬于高感類型（表2），表明當(dāng)?shù)氐疚敛“l(fā)病嚴重，是理想的稻瘟病自然誘發(fā)鑒定病圃。同時對比人工接種鑒定結(jié)果與自然鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)人工鑒定的各個材料的穗瘟抗性表現(xiàn)與在金壇、廬江和長興的自然鑒定抗性表現(xiàn)基本一致，其決定系數(shù)（2）分別為0.7828、0.6788和0.8236（圖4-A）。此外，PPL、PPL和PPL3個雙基因聚合系在不同鑒定點抗性效應(yīng)最好也最為穩(wěn)定，小區(qū)健康稻穗率均在94.00%以上，與人工鑒定結(jié)果基本一致（圖4-B、表2）。其他雙基因聚合系的田間穗瘟抗性水平存在顯著差異，且在不同鑒定點間抗性水平表現(xiàn)明顯的特異性。如PPL在廬江的小區(qū)健康稻穗率為91.00%，表現(xiàn)為3級抗性水平；而在金壇和長興的小區(qū)健康稻穗率分別為77.00%和69.00%，表現(xiàn)為7級感病水平（圖4-B、表2）。表明基因組合的抗性表現(xiàn)存在地區(qū)特異性，對金壇和長興的稻瘟病菌群體表現(xiàn)一定程度的特異親和性。

A：雙基因聚合系苗瘟抗性效應(yīng)分析桑基圖Analysis of resistance effect of PPLs against seedling blast with sankey diagram；B：雙基因聚合系穗瘟抗性效應(yīng)分析?；鶊DAnalysis of resistance effect of PPLs against panicle blast with sankey diagram。OE：重疊效應(yīng)overlapping effect；CE：互補效應(yīng)complementary effect；IE：互作效應(yīng)interaction effect

2.5 雙基因聚合系的基本農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

考察了雙基因聚合系和輪回親本07GY31的基本農(nóng)藝性狀（表2）。結(jié)果表明，大多數(shù)雙基因聚合系的農(nóng)藝表現(xiàn)，如株高、抽穗期以及單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重及單株產(chǎn)量等均與輪回親本07GY31無明顯差異，而攜帶有的雙基因聚合系與輪回親本相比則表現(xiàn)為生育期提前，從產(chǎn)量構(gòu)成性狀看，盡管其千粒重與輪回親本無差異，但每穗總粒數(shù)和結(jié)實率顯著降低，最終導(dǎo)致單株產(chǎn)量顯著降低。

3 討論

3.1 含有Pigm的基因組合為有效的抗性基因組合模式

稻瘟病菌生理小種的組成及頻率在不同地區(qū)、不同年份間存在很大的差異和變化。研究結(jié)果表明，我國稻瘟病菌生理小種的地理分布存在明顯的地域差異，且秈、粳稻上病菌的致病性也有明顯分化，秈型小種主要分布于南方秈稻區(qū)，而粳型小種則以北方粳稻區(qū)和長江下游秈、粳稻混栽區(qū)居多[30,44]。在大田種植過程中水稻與稻瘟病菌之間會發(fā)生協(xié)同進化，因此評價一個抗性基因的效應(yīng)不能僅用少數(shù)幾個菌株進行鑒定；同樣在抗性品種推廣應(yīng)用之前，也需用采用當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)區(qū)有代表性的菌株加以鑒定。在本研究中，利用長江下游109個粳型代表性菌株對構(gòu)建的18個基因組合進行抗性評價，并分別在江蘇金壇、安徽廬江和浙江長興進行自然誘發(fā)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙基因聚合系PPL、PPL、PPL在苗瘟和穗瘟人工接種中表現(xiàn)出廣譜抗性，其苗、穗瘟抗性頻率分別在85.71%、85.71%和82.14%以上，并在不同病圃也表現(xiàn)出穩(wěn)定的廣譜抗性，小區(qū)健康稻穗率分布在94.00%—100.00%。前期筆者采集了158個來自南方稻區(qū)的秈型菌株對秈稻背景的不同基因組合進行抗性鑒定，/、/和/3個基因組合同樣表現(xiàn)出廣譜抗性，其苗瘟和穗瘟抗性頻率分別在92.41%和86.67%以上，并且在3個南方秈稻病圃里面表現(xiàn)出穩(wěn)定而廣譜的抗性水平[29]。這些結(jié)果表明基因組合/、/和/不僅對長江下游粳型稻瘟病菌菌群表現(xiàn)出廣譜抗性，同樣對南方秈型菌群表現(xiàn)廣譜抗性，是具有重要應(yīng)用價值的廣譜稻瘟病抗性基因組合模式。

A：3個病圃的不同雙基因聚合系的小區(qū)健康穗率與人工接種下穗瘟抗性頻率之間的關(guān)系Relationship between HPP of PPLs at three disease nurseries and the RF of PPLs in artificial inoculation evaluation；B：雙基因聚合系在不同病圃的穗瘟抗性表現(xiàn)Resistance performance of PPLs against panicle blast among different disease nurseries。JT：金壇Jintan；LJ：廬江Lujiang；CX：長興Changxing

3.2 不同基因組合方式影響聚合系的抗性效應(yīng)

在優(yōu)良受體親本中聚合非等位抗性基因可有效提高目標材料對稻瘟病廣譜抗性，但是對所要聚合的目標基因的選擇尤為重要。因為兩個非等位抗性基因聚合后，并不簡單地表現(xiàn)為單個抗病基因的抗譜之間的簡單累加，而是抗性基因之間表現(xiàn)為極顯著的基因相互作用，產(chǎn)生多種聚合效應(yīng)[45-47]，在本研究中將其歸類為重疊效應(yīng)、互補效應(yīng)和互作效應(yīng)。基因聚合效應(yīng)的構(gòu)成因子極為復(fù)雜，不同基因組合方式會產(chǎn)生不同的聚合效應(yīng)；同一個基因與不同基因聚合也會產(chǎn)生不同的聚合效應(yīng)。以含有的雙基因聚合系穗瘟抗性效應(yīng)為例，單基因系穗瘟抗性效應(yīng)僅為35.71%，與（RF=39.29%）聚合后分別產(chǎn)生了14.29%的重疊效應(yīng)、28.57%的互補效應(yīng)和3.57%的互作效應(yīng)，導(dǎo)致雙基因聚合系PPL的抗性效應(yīng)為46.43%；與（RF=35.71%）聚合后分別產(chǎn)生了10.71%的重疊效應(yīng)、21.43%的互補效應(yīng)和14.29%的互作效應(yīng)，導(dǎo)致雙基因聚合系PPL的抗性效應(yīng)為46.43%；而與（RF=28.57%）聚合后則分別產(chǎn)生了7.14%的重疊效應(yīng)、28.57%的互補效應(yīng)和28.57%的互作效應(yīng)，導(dǎo)致雙基因聚合系PPL的抗性效應(yīng)為64.28%（圖2-D）。兩個非等位基因聚合后相互作用的分子機制十分復(fù)雜，目前還不清楚，然而聚合能夠識別不同菌株的抗性基因仍是提高目標材料廣譜抗性的有效途徑之一，但是在聚合過程中必須對單個目標基因的抗性水平及聚合后的抗性效應(yīng)進行比較分析，選擇互補效應(yīng)高且能產(chǎn)生較強互作效應(yīng)的抗病基因組合模式，才能有效提高目標材料的廣譜抗性。

表2 18個雙基因聚合系及輪回親本07GY31的基本農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）Different lowercase letters after the data in the same column indicate significant difference (＜0.05)

3.3 不同受體遺傳背景影響基因組合的抗性效應(yīng)

受體的遺傳背景影響抗性基因/組合的抗性效應(yīng)[48]。研究表明在3種不同遺傳背景下對來自日本的稻瘟病菌菌株表現(xiàn)為部分抗性，而在TP309遺傳背景下則對來自中國的稻瘟病菌菌株表現(xiàn)完全抗性[22,49]?？剐曰蚝驮诙i、粳基因組中均有分布，但僅在秈稻背景下有較好的抗性效應(yīng)，而僅在粳稻背景下檢測到對抗性表型有較大的貢獻[34]。同樣在水稻白葉枯病抗性中也發(fā)現(xiàn)受體品種的遺傳背景可能會影響抗性基因的抗性表型，如基因組合在5個不同水稻受體品種中的抗性表現(xiàn)差異顯著，表明在某些水稻品種背景中可能存在抗性基因組合的抑制因子[50]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)基因組合在粳稻07GY31背景下的苗瘟及穗瘟抗性頻率分別為69.72%和46.43%，而在秈稻揚稻6號背景下的苗瘟及穗瘟抗性頻率則分別達到了95.57%和83.33%[29]；同樣地，基因組合在粳稻07GY31背景下的苗瘟及穗瘟抗性頻率分別為37.61%和32.14%，而在秈稻揚稻6號背景下的苗瘟及穗瘟抗性頻率則分別達到了91.14%和70.00%[29]；有趣的是基因組合/在粳稻背景下的苗瘟及穗瘟抗性頻率分別為91.74%和75.00%，高于秈稻揚稻6號背景下的苗瘟及穗瘟抗性頻率（86.71%和66.67%）[29]。這些結(jié)果表明不同遺傳背景中可能存在不同的抗性基因組合促進/抑制因子，這就暗示在不同生態(tài)區(qū)，不同遺傳背景下選擇合適的抗性基因組合，做到抗性基因組合的合理布局，才能有針對性地培育廣譜持久抗性品種。

4 結(jié)論

抗性基因的組合方式直接影響了聚合系的抗性水平，而互補效應(yīng)高且能有效表達是粳型雙基因聚合系抗性效應(yīng)提高的關(guān)鍵因子。雙基因聚合系PPL、PPL和PPL在苗瘟和穗瘟人工接種及病圃自然誘發(fā)鑒定中均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，為長江下游粳稻的廣譜抗性基因組合模式。研究結(jié)果可為長江下游廣譜稻瘟病抗性粳稻品種選育提供種質(zhì)資源和理論支撐。

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Construction and Analysis of Broad-spectrum Resistance Gene Combination Pattern forRice in Lower Region of the Yangtze River, China

Wu YunYu1,2, Xiao Ning1,2,4, Yu Ling1,2, Cai Yue1,2, Pan CunHong1,3, Li YuHong1,2, Zhang XiaoXiang1,2, Huang NianSheng1,2, Ji HongJuan1,2, Dai ZhengYuan1,3, Li AiHong1,2,3

1Lixiahe Institute of Agricultural Sciences of Jiangsu, Yangzhou 225007, Jiangsu;2Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu;3Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu;4State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

【】Gene pyramiding is one of the most effective ways to achieve broad-spectrum resistance against. The objective of this study is to construct a set of polygene pyramiding lines (PPLs) under the background ofrice, to evaluate their resistance performances and analysis the components of their resistance effects usingstrains collected from lower region of the Yangtze River, China, thus providing broad-spectrum resistance gene combination pattern and germplasm resources forrice resistance breeding in lower region of the Yangtze River, China.【】Monogenic lines with multiple alleles of the Piz locus (,,,,and) with the background ofrice 07GY31 as the backbone, crossed with other broad-spectrum resistance gene,and, respectively using the incomplete NCII mating design. A total of 18 different PPLs were constructed using marker-assisted selection (MAS) and agronomic traits screening. Artificial inoculation assays at seedling and heading stage with 109 representativestrains collected from lower region of the Yangtze River, combined with natural induction identification under multiple field environments were conducted to evaluate the resistance performances of different PPLs, and to analyze the component factors of the resistance effects of the PPLs.【】Genotyping by sequencing (GBS) analysis shows that the constructed PPLs all have a high background recovery rate, which was ranging from 97.08% (PPL) to 99.08% (PPL), indicated that the genetic background of all PPLs was almost fully identical to that of the recurrent parent 07GY31. The seedling blast and panicle blast resistance levels of most PPLs were significantly higher than those of monogenic lines under artificial inoculation conditions, the PPLs with better resistance to seedling blast are PPL, PPL, PPL, PPL, PPL, PPL, PPL, PPLand PPL, respectively, and the PPLs with outstanding performance in panicle blast are PPL, PPL, PPL, PPL, PL, PPLand PPL, respectively. Different resistance gene combinations produced different effects after pyramiding. High complementary effect and which could be fully expressed is the key factor for the improvement of the resistance level of seedling blast and panicle blast of the PPLs. In addition, PPL, PPLand PPLdisplayed broad-spectrum resistance in artificial inoculation at seedling and heading stage, and showed stable broad-spectrum resistance under different disease nurseries. Besides, agronomic traits evaluation also showed PPLs with these three gene combinations were at par to the recurrent parent. Therefore,,andare broad-spectrum resistance gene combination patterns suitable forrice resistance breeding in lower region of the Yangtze River, China.【】The combination pattern of resistance genes affects the resistance level of the PPLs, and high complementary effect and which could be fully expressed is the key factor for the improvement of the resistance level of the PPLs inbackground. In addition, the development of PPLs and component factors analysis in this study provides valuable theoretical support and innovative germplasm resources for the precise breeding broad-spectrumvarieties in lower region of the Yangtze River, China.

lower region of the Yangtze River;rice;; rice blast; gene pyramiding; effect analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.006

2020-07-13；

2020-08-24

國家自然科學(xué)基金（31801342，31971868）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金（CX（18）2022）、江蘇省重點研發(fā)計劃（BE2019339）、江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（PZCZ201702）、江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室（BM2018003）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20181216）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室開放基金（SKLOF201909）

吳云雨，E-mail：wuyunyuyu@163.com。通信作者李愛宏，E-mail：yzlah@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）