不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構及其影響因素*

裴泓霖 王 犖 譚八梅 李偉嘉 甄 昊 丁 君 常亞青

(大連海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室 大連 116023)

刺參(Apostichopus j aponicus)因具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值，深受消費者青睞。隨著刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，池塘養(yǎng)殖已成為刺參增養(yǎng)殖的重要方式(常亞青等, 2006)。在集約化養(yǎng)殖過程中，殘餌及養(yǎng)殖生物糞便的堆積易引起底質惡化，對養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)健康存在潛在危害(董雙林, 2015; 王姣, 2016)。

養(yǎng)殖池塘沉積物菌群作為養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅在水體物質循環(huán)及能量流動過程中發(fā)揮巨大的作用(Bentzon-Tilia et al, 2016)，對其養(yǎng)殖生物的生長、消化、免疫、疾病等均存在相關性(Becker et al, 2004; Wang et al, 2005; 高菲等, 2010)。研究表明，藍細菌(Cyanobacteria)能將溶解有機碳轉化為自身的顆粒有機碳，從而完成碳轉換與儲存(周偉華等,2007)；假單胞菌屬(Pseudomonas)菌群能利用反硝化作用將硝酸鹽還原為氮氣(肖晶晶等, 2009)；鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)中某些菌種對有機磷和無機磷的分解具有明顯作用(孫亞凱, 2006)；脫氮硫桿菌(Thiobacillus denitrificans ) 、 反 硝 化 硫 微 螺 菌(Thiomicrospira deni trificans) 、 多 樣 硫 桿 菌(Thiobacillusd versutus )等菌群能從多種還原態(tài)無機硫的氧化中獲得能量，同時，還原硝酸鹽或亞硝酸鹽產(chǎn)生氮氣(Pokorna et al, 2015)；嘉利翁氏菌屬(Gallionella)、海桿菌屬(Mariprofundus)、Sideroxydans 能夠將Fe2+氧化為Fe3+，而Fe3+可以作為電子受體進行能量代謝，從而完成鐵循環(huán)(Edwards et al, 2003; Emerson et al,2004)。因此，有效利用某些微生物的生理功能來保持養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的微生態(tài)平衡，對防治池塘養(yǎng)殖環(huán)境惡化以及促進養(yǎng)殖生物健康生長具有重要意義(王鑫毅等, 2019)。然而，養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)菌群結構極易受到外部環(huán)境理化因子的影響，季節(jié)變動、營養(yǎng)物質輸入等變化均可造成池塘養(yǎng)殖環(huán)境菌群種類和豐度的改變，間接影響?zhàn)B殖生物的生長及健康(Sunde et al, 2001; Suzuki et al, 2019)。

為探明不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構及其影響因素，本研究選取遼寧省營口地區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘為研究對象，基于高通量測序技術，揭示不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構的季節(jié)性差異和共性，查明影響刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構的主導環(huán)境因子，以期為刺參養(yǎng)殖池塘微生態(tài)調(diào)控和綠色健康養(yǎng)殖提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取遼寧營口(40°37′46″ N；122°8′59″ E)刺參養(yǎng)殖池塘為研究對象，于2019 年1 月(冬季)、4 月(春季)、8 月(夏季)、10 月(秋季)，利用柱狀采泥器，在同一刺參養(yǎng)殖池塘對角線兩側離岸1.5 m 及正中間處采集表層(5 cm)沉積物樣品，裝入無菌離心管，-80℃冷凍保存。將每次采集的5 個沉積物樣品等量混勻送檢，每個樣品進行3 次重復。

采樣池塘僅養(yǎng)殖刺參單一品種，放養(yǎng)刺參密度約為8～10 頭/m2，刺參規(guī)格約為100 g/頭。池塘面積約為0.1 km2，水深2～3 m，底質多泥質，水源來自近海海域，利用潮汐帶來的潮差進水和排水。全年不投喂飼料及益生菌，保證刺參自然生長。

1.2 環(huán)境因子測定

環(huán)境因子監(jiān)測點位同沉積物采樣點，每個采樣點測定環(huán)境指標均進行3 次重復。采用HACH(HQd)水質分析儀器，在養(yǎng)殖池塘現(xiàn)場測定溫度、鹽度和pH。沉積物總有機碳(TOC)的測定采用重鉻酸鉀氧化-還原容量法，總氮(TN)采用過硫酸鉀氧化法，總磷(TP)采用鉬銻抗分光光度法，氨氮(-N)采用次溴酸鹽氧化法，硝酸鹽(-N)采用鎘柱還原法，亞硝酸鹽(N)采用萘乙二胺分光光度法，磷酸鹽(-P)采用磷鉬藍分光光度法，硫化物采用亞甲基藍分光光度法，氧化還原電位采用堿性高錳酸鉀法。

1.3 DNA 提取

選用OMEGA Soil DNA 試劑盒提取刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境樣品總DNA，為確保DNA 無降解無污染，DNA 濃度要求≥50 ng/μl，OD260/280=1.8～2.0。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，條帶清晰完整、無拖尾，質量合格。

1.4 PCR 擴增與高通量測序

細菌16S rRNA 基因V3～V4片段的擴增引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-G ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)，應用Illumina MiSeq測序平臺完成序列測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Usearch 軟件，以97%閾值開展OTU(Optical Transform Unit)操作分類單元聚類(Blaxter et al ,2005)。選用RDP classifier 軟件(Wang et al, 2007)進行物種分類操作，閾值設置為0.8，低于該閾值的分類結果被劃歸為Unclassified 一類。利用Qiime 軟件(Caporaso et al, 2010)進行多樣性分析?；贠TU 聚類和環(huán)境因子信息，利用R 語言的Vegan package(Oksanen et al, 2010)進行環(huán)境因子相關性分析。通過最大似然法構建進化樹。根據(jù)物種分類結果得到不同水平上各Rank 的豐度值，采用STAMP 軟件(版本2.1.3)，比較樣本之間豐度差異，P＜0.05 為差異顯著，比較樣本組間豐度差異。

2 結果與分析

2.1 環(huán)境因子監(jiān)測

遼寧營口刺參養(yǎng)殖池塘不同季節(jié)沉積物環(huán)境因子監(jiān)測數(shù)據(jù)如表1 所示。根據(jù)中華人民共和國國家標準《海洋沉積物質量(GB 18668-2002)》，所有樣品均符合國家Ⅰ類沉積物標準。所監(jiān)測的環(huán)境因子理化指標，均呈顯著的季節(jié)性差異。其中，總氮、氨氮、硝酸鹽、總磷和硫化物含量均在夏季最高；TOC 含量在秋季最高，春季最低。

2.2 高通量測序結果

不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物樣品高通量測序結果見表 2，從表 2 可以看出，共得到原始序列37690～87024 條，有效序列41562～79288 條，聚類于36980～3913 個 OTUs。樣品測序覆蓋率為 95.9%～99.6%，表明測序結果可以真實反映樣本信息。稀釋曲線趨于平坦，表示測序數(shù)據(jù)深度足夠反映樣品的多樣性。

2.3 α 多樣性分析

Chao1 和Ace 指數(shù)常用于估算樣品中菌群的豐度；Shannon 和Simpson 指數(shù)常用于估算樣品中菌群的多樣性。

表1 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物環(huán)境因子Tab.1 Environmental factors of sediment in Apostichopus japonicus culture pond in different seasons

表2 高通量測序結果Tab.2 Results of high-throughput sequencing

比較不同季節(jié)α 多樣性指數(shù)得出(圖1)，營口地區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性具有顯著性季節(jié)差異。其中，夏季菌群豐度和多樣性顯著升高；其他季節(jié)菌群豐度和多樣性均有不同程度的下降，具體表現(xiàn)為秋冬兩季菌群豐度極顯著性下降(P＜0.01)，且冬季菌群物種豐度達四季最低。

2.4 β 多樣性分析

在OTU 水平上，根據(jù)加權Unifrac 距離對不同季節(jié)樣本進行三維主坐標分析(圖 2)。其中，PCoA1(Principal Co-ordinates analysis)的貢獻率為55%，PCoA2的貢獻率為35%，PCoA3 的貢獻率為4%，總貢獻率為94%。同一季節(jié)樣品均聚集在一起，顯示出較好的生物學重復性。不同季節(jié)相比較，秋季與其他季節(jié)沉積物菌群結構具有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 α 多樣性指數(shù)Fig.1 Alpha diversity index

圖2 PCoA 三維分析Fig.2 PCoA three-dimensional analysis

2.5 菌群結構特征

基于GraPhlAn 分類和系統(tǒng)發(fā)育信息可視化圖(圖3)可以看出，不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物第一優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)(相對豐度＞43.19%)，次優(yōu)勢菌門存在顯著差異。其中，綠彎菌門(Chloroflexi)(相對豐度＞7%)為春季次優(yōu)勢菌門；擬桿菌門(Bacteroidetes)(相對豐度＞8.13%)為夏季次優(yōu)勢菌門，厚壁菌門(Firmicutes)(相對豐度＞17.96%)為秋、冬季次優(yōu)勢菌門。

菌屬水平下，優(yōu)勢菌屬呈現(xiàn)出顯著的季節(jié)性差異(P＜0.05)。其中，春季優(yōu)勢菌主要隸屬于Sulfurovum、Thioprofundum、除硫單胞菌屬(Desulfuromonas)、Desulfosarcina 和Desulfopila。夏季優(yōu)勢菌屬主要隸屬于Sulfurovum、Halioglobus、Haliea、Thioprofundum、Desulfuromonas、Desulfopila 和Desulfobulbus。秋季優(yōu)勢菌主要隸屬于Sulfurovum、Desulfuromonas、Desulfuromusa、Desulfosarcina、Desulfopila 和海桿菌屬(Marinobacter)。冬季優(yōu)勢菌主要隸屬于檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Desulfuromonas、Pelobacter、Desulfosarcina、Desulfopila、Desulfobulbus、不動桿菌屬(Acinetobacter)和Exiguobacterium。春、夏、秋、冬 4 季沉積物優(yōu)勢菌屬均包含脫硫八疊菌Desulfosarcina、Desulfuromonas 和Desulfopila。

LEfSe (LDA Effect Size)差異性分析結果顯示(圖4)，共有不同分類水平的98 個細菌群類在4 個季節(jié)中存在顯著差異。其中，變形菌門在4 個季節(jié)中都存在差異菌群，如檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬是隸屬于春季的差異菌屬；外硫紅螺旋菌科(Ectothiorhodospiraceae)、交替單胞菌目(Alteromonadales)是隸屬于夏季的差異菌目； 彎曲菌目(Campylobacterales)、Sulfurovum 是隸屬于秋季的差異菌；著色菌目Chromatiales、Thiohalomonas 是隸屬于冬季的差異菌目。此外，春季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物差異菌門主要隸屬于擬桿菌門(Bacteroides)和酸桿菌門(Acidobacteria)，其代表性差異菌屬分別為Cytophagla和Gp21。夏季沉積物差異菌門主要隸屬于酸桿菌門、疣微菌門(V e r r u c o m i c r o b i a)和浮霉菌門(P l a n c t o m y c e t e s)，分別以 G p 2 3、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)和浮霉菌科(Planctomycetaceae)為代表。秋季沉積物差異菌門隸屬于擬桿菌門和厚壁菌門，其代表性差異菌屬為 Mangrovibacterium 和Natranaerovirga。冬季沉積物差異菌門則隸屬于放線菌門(Actinobacteria)以Actinomycetales 為代表。

2.6 菌群結構與環(huán)境因子相關性分析

RDA 是將對應分析與多元回歸分析混合的一種分析方法。營口地區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群與環(huán)境因子RDA(Redundancy Analysis)分析結果顯示(圖5)，春季和夏季在第2 象限中基本處于同一位置，顯示影響春夏兩季沉積物菌群結構的環(huán)境因子相似。根據(jù)環(huán)境因子與原點連線的長度可知，溫度、TN、pH 和TOC 是營口刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群的主導環(huán)境因子。其中，溫度、TN、pH 與春、夏季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群相對豐度呈正相關，與秋、冬季菌群相對豐度呈負相關；TOC 與秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘菌群相對豐度呈正相關，與春、夏季菌群相對豐度呈負相關。

圖4 不同季節(jié)沉積物菌群LEfSe 分析Fig.4 LEfSe analysis of sediment bacterial community in different seasons

圖5 沉積物菌群與環(huán)境因子RDA 分析Fig.5 RDA analysis of sediment bacterial community and environmental factors

不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物差異菌群與主導環(huán)境因子相關性分析結果見表3。其中，擬桿菌門與TOC 含量呈極顯著負相關(P＜0.01)，表明擬桿菌門受沉積物有機物質含量影響顯著。酸桿菌門與pH 和TN 呈極顯著正相關(P＜0.01)。疣微菌門和浮霉菌門與TN 含量呈極顯著正相關(P＜0.01)。厚壁菌門與TN 呈極顯著負相關(P＜0.01)，與TOC 含量呈極顯著正相關(P＜0.01)。放線菌門則與pH 和TOC 呈顯著相關性(P＜0.05)。

表3 沉積物優(yōu)勢菌群與主導環(huán)境因子相關性分析Tab.3 Correlation analysis between dominant bacterial community and environment factors in sediment

3 討論

3.1 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群多樣性

微生物是養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)和能量流動過程中發(fā)揮著重要作用，對維持生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要意義(Rungrassamee et al, 2016; Xiong et al, 2016; 金笑等, 2017)。本研究結果顯示，營口地區(qū)不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性呈現(xiàn)出顯著的季節(jié)演替特征。其中，夏季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性最高，冬季沉積物菌群豐度和多樣性則最低。已有的研究表明，溫度是影響環(huán)境微生物生命活動的重要因素之一，高溫通過加速細菌體內(nèi)酶活性，促進微生物代謝，加速有機物分解，為微生物生長繁殖提供有利條件(李彬等, 2010; Cardona et al, 2016)。同時，氮、磷等營養(yǎng)物質的增多，也為細菌生長創(chuàng)造了適宜的條件，使菌群豐度和多樣性更豐富(董學興等, 2019)。營口地區(qū)夏季刺參養(yǎng)殖池塘水環(huán)境溫度和氮磷含量相對較高，為沉積物中微生物的繁殖提供了良好的生存環(huán)境，因此，夏季沉積物菌群豐度和多樣性顯著高于其他季節(jié)。

3.2 不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構及其影響因素

本研究中，不同季節(jié)營口地區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物第1 優(yōu)勢菌門均為變形菌門，與已有的研究報道一致(竇妍等, 2014、2016; 丁斯予等, 2019)。變形菌門作為養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的第1 優(yōu)勢菌門，主要是由其在原核生物分子生物學分類中的絕對優(yōu)勢所決定的(Gupta et al, 2000)。變形菌門下多個細菌群類均為池塘底棲環(huán)境中常見的固氮菌，參與池塘生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)，在池塘養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要的生態(tài)學地位(劉思亮等, 2002; 龔駿等, 2010)。刺參養(yǎng)殖池塘沉積物除變形菌門為第1 優(yōu)勢菌門外，其他優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、酸桿菌門、疣微菌門、厚壁菌門等，與營底棲生活的縊蟶(Sinonovacula const ricta)相近(王毅鑫等, 2019)，與雜食性的羅非魚池塘沉積物菌群差別較大(史麗娜等, 2015)。養(yǎng)殖品種食性的差異會導致飼料投入不同，造成池塘沉積物中有機物和營養(yǎng)鹽濃度產(chǎn)生差異。除飼料不同之外，刺參的攝食方式為吞食沉積物，造成沉積物菌群結構發(fā)生一定改變(于東祥,2010)。因此，刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構具有特異性。

比較不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結構特征的結果顯示，刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群存在顯著的季節(jié)性差異，特異性菌群相對豐度與其生境因子之間存在顯著性相關，影響沉積物菌群的主導環(huán)境因子為溫度、TOC、TN 和pH，且所有主導環(huán)境因子均呈現(xiàn)出顯著的地域差異。已有的研究表明，微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)物質主要依靠環(huán)境中的無機鹽和有機物，其群落組成對環(huán)境因子變化有著較強的敏感性(王軼南等, 2010; Bell et al, 2013; 李建光等, 2014;Yang et al, 2015; Amabebe et al, 2020)。微生物菌群特征是其生境的反映，與環(huán)境理化性質密切相關且相互限制影響(閆法軍等, 2014)。其中，春季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物特異性菌群主要以擬桿菌門為代表。擬桿菌門細菌與微生物蛋白質和脂類等有機物的轉化密切相關(Ren et al, 2015)，是維持環(huán)境碳循環(huán)的主要動力，且與春季沉積物環(huán)境中TOC 含量顯著性相關。夏季沉積物特異性菌群以酸桿菌門、疣微菌門和浮霉菌門為代表。夏季隨著溫度的升高，養(yǎng)殖生物代謝加快，排泄物增多，易導致硫、鐵等元素在池底大量堆積，使養(yǎng)殖池塘底部沉積物pH 下降，為具有嗜酸特性的酸桿菌門繁殖提供了有利條件(Barns et al, 2007;劉彩霞等, 2016)。此外，夏季沉積物中含氮物質的增高會造成水體富營養(yǎng)化，導致藍藻暴發(fā)，也會對水生生物的生長產(chǎn)生不良影響(付瑩等, 2018)。然而，疣微菌門細菌的存在可以有效利用夏季沉積物環(huán)境中的氮元素，加速氮循環(huán)進程(Shen et al, 2017)。夏季沉積環(huán)境中高含量的氮和硫，則有利于浮霉菌門細菌的生長繁殖(黃佩蓓等, 2014)。厚壁菌門細菌能夠有效利用環(huán)境中硝酸鹽和亞硝酸鹽，進而降低沉積物中的氮含量，作為秋季特異性菌群，與其沉積物中較低的氮含量呈現(xiàn)出一致性。冬季隨著氣溫的下降，沉積物中微生物豐度和多樣性均受到不同程度的抑制，而放線菌門細菌因能形成抗逆性極強的芽孢，從而具有極強的環(huán)境適應性(王蓉等, 2013)，成為冬季沉積物特異性菌群。此外，放線菌門具有降解淀粉、蛋白等大分子的功能，產(chǎn)生的抗菌素類物質能抑制環(huán)境中其他革蘭氏陽性細菌發(fā)揮作用，有成為益生菌的潛力(李文均等, 2002)。

值得注意的是，夏季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物中厚壁菌門相對豐度極顯著低于其他季節(jié)，相對豐度僅為0.5%。而隸屬于厚壁菌門、芽孢桿菌目(Bacillales)的芽孢桿菌屬是典型的益生菌，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘環(huán)境微生態(tài)調(diào)控(杜佗等, 2017)。芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種消化酶和營養(yǎng)物質，供養(yǎng)殖動物吸收利用，還可以通過改善水產(chǎn)動物體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境進而提高動物機體免疫力，同時，具有凈化水質和清除自由基的功效(蘇艷莉等, 2016)。因此，建議在夏季池塘中添加適當含量的芽孢桿菌，用于協(xié)助刺參安全度夏。

4 結論

本研究結果表明，營口地區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性存在顯著性季節(jié)變化特征，溫度、總有機碳、總氮和pH 是影響沉積物菌群的主要環(huán)境因子。本研究初步探明沉積物菌群與主導環(huán)境因子間的相關性，而菌群與環(huán)境因子間的互作機制還有待于進一步深入探究。