刺參基因組DNA 甲基化水平及模式對(duì)溫度變化的響應(yīng)*

溫爭(zhēng)爭(zhēng) 左 閃 陳 夢(mèng) 周紅學(xué) 孫國(guó)華馮艷微 王衛(wèi)軍 楊建敏

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 上海 201306；3. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 煙臺(tái) 264025；4. 山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳 濟(jì)南 250013；5. 煙臺(tái)海育海洋科技有限公司 煙臺(tái) 264001)

刺參(Apostichopus j aponicus)是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種之一，自然分布在35～44°N 的西北太平洋沿岸，包括中國(guó)黃渤海海域、俄羅斯東部沿岸、日本和韓國(guó)沿岸。刺參是典型的溫帶種類，水溫變化對(duì)刺參的攝食、代謝和生殖發(fā)育等各種生理活動(dòng)有重要影響(曹學(xué)順, 2014)。溫度過(guò)高或過(guò)低都不適宜刺參的生長(zhǎng)，尤其是在高溫逆境環(huán)境中，刺參的活動(dòng)和攝食降低，甚至體內(nèi)自由基代謝紊亂、病變死亡(謝兆文等,2016; 高楊, 2017)。溫度變化對(duì)刺參生理變化、生長(zhǎng)發(fā)育和遺傳變化的影響研究一直受到廣泛關(guān)注。

表觀遺傳學(xué)是一種不改變DNA 序列的可遺傳變異，它的調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括DNA 甲基化修飾、組蛋白修飾、染色體重塑、非編碼RNA 調(diào)控等，這些修飾方式之間相互作用、共同調(diào)節(jié)基因組的功能(Crabtree,2020; Kulis et al, 2010)，且這些表觀遺傳修飾極易受到環(huán)境的誘導(dǎo)(康靜婷等, 2013)。DNA 甲基化是基因組DNA 的一種重要修飾方式，通過(guò)影響核酸空間構(gòu)象、穩(wěn)定性及其與蛋白質(zhì)相互作用方式參與基因表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等過(guò)程(鐘焱等, 2019)。在水產(chǎn)動(dòng)物中，環(huán)境通過(guò)影響DNA甲基化水平進(jìn)而影響基因表達(dá)，從而使生物的生理活動(dòng)及表型發(fā)生變化以適應(yīng)環(huán)境(McGhee et al, 2014)。Navarro-Martin 等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化介導(dǎo)了溫度影響歐洲鱸魚(Dicentrarchus l abrax)性別變化的生物學(xué)過(guò)程；吳彪等(2016)研究表明，蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)受到急性升溫脅迫處理后，基因組DNA 總甲基化率下降；Li 等(2017)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)肝臟后，生長(zhǎng)相關(guān)基因igf1 的外顯子甲基化水平與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在刺參應(yīng)對(duì)逆境響應(yīng)方面，也有研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。高杉等(2017)采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)分析了健康和“化皮病”刺參體壁組織的甲基化水平差異。李尚俊等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，在高溫環(huán)境下，刺參的表觀修飾相關(guān)基因(DNMT1、HDAC3 和MLL5)的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。趙業(yè)(2015)研究發(fā)現(xiàn)，刺參夏眠期的甲基化水平高于非夏眠期。鄒榮婕等(2014)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)啉類藥物處理的刺參組織DNA 甲基化水平低于對(duì)照組，說(shuō)明DNA 甲基化在刺參應(yīng)對(duì)外界刺激的重要作用。

本研究采用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)(WGBS)，對(duì)不同溫度處理的刺參的消化道組織的全基因組C 位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，探討溫度變化對(duì)刺參基因組DNA 甲基化的影響。同時(shí)，以刺參的體壁、消化道、縱肌和呼吸樹為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)甲基化酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)，分析溫度對(duì)刺參不同組織的甲基化程度的影響，探究刺參DNA 甲基化調(diào)控與組織特異性的相關(guān)性，以期從DNA 甲基化水平解釋刺參響應(yīng)溫度變化的生理過(guò)程，為深入研究環(huán)境與表觀遺傳變異的關(guān)系及逆境響應(yīng)機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用2 齡刺參由山東省東營(yíng)市華春漁業(yè)有限公司提供，體質(zhì)量為(130.3±5.5) g，從養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖群體中隨機(jī)采集，定時(shí)投喂飼料，每日換水量為1/3，養(yǎng)殖期間持續(xù)充氣。

1.2 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)與樣品采集

實(shí)驗(yàn)用刺參在水溫為(20.0±0.5)℃的實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)5 d，暫養(yǎng)結(jié)束后，分組進(jìn)行不同溫度養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組(T20)刺參在(20.0±0.5)℃水溫下持續(xù)養(yǎng)殖至取樣；實(shí)驗(yàn)A 組(T26)從水溫(20.0±0.5)℃以0.6℃/d的速度在10 d 內(nèi)提高至(26.0±0.5)℃后，維持養(yǎng)殖至取樣；實(shí)驗(yàn)B 組(T32)從水溫(20.0±0.5)℃以0.6℃/d的速度10 d 內(nèi)提高至(26.0±0.5)℃后，再以2℃/d 的速度在3 d 內(nèi)提高至(32.0±0.5)℃，保持2 d。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)平行，所有實(shí)驗(yàn)組刺參樣品15 d 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后取樣，每個(gè)平行組取10 個(gè)刺參，分別剖取呼吸樹、縱肌、消化道和體壁組織，并用滅菌生理鹽水(1.5% NaCl)沖洗，置于2 ml 凍存管后迅速放入液氮罐中，送回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃。

1.3 基因組DNA 的提取

DNA 提取采用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的濃度和純度，將各組樣品的濃度調(diào)整為100～200 ng/μl，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 高溫處理后消化道的全基因組DNA 甲基化測(cè)序

重亞硫酸鹽WGBS 實(shí)驗(yàn)步驟參考郭添福等(2018)的高分辨率甲基化分析方法，進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行DNA甲基化定量。主要構(gòu)建流程包括：檢測(cè)合格的刺參消化道基因組DNA 樣品，首先，用超聲波打成平均大小為200～300 bp 的片段，對(duì)打斷后的DNA 片段進(jìn)行末端修復(fù)、腺苷酸化，并添加接頭；隨后，進(jìn)行Bisulfite處理(EZ DNA Methylation GoldTMKit, Zymo Research)，經(jīng)處理后，未發(fā)生甲基化的C 變成U，而甲基化的C 保持不變；最后，對(duì)單鏈DNA 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix)得到DNA 文庫(kù)，庫(kù)檢合格后，利用Illumina HiSeq 進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)PE150，構(gòu)建Bisulfite 全基因組甲基化圖譜，測(cè)序在北京諾禾致源有限公司完成。

1.5 ELISA 測(cè)定不同組織DNA 甲基化水平

提取刺參縱肌、呼吸樹、消化道和體壁4 個(gè)組織的基因組DNA，利用Zymo Research 公司的5-mC DNA ELISA 試劑盒檢測(cè)相應(yīng)樣品基因組DNA 甲基化水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟：待測(cè)樣品基因組DNA 和標(biāo)準(zhǔn)品(100 ng)均稀釋成100 μl 反應(yīng)液，于PCR 儀98℃變性5 min，冰浴10 min，移至96 孔板，37℃孵育1 h，緩沖液洗板3 次，37℃孵育30 min。最后，加入甲基化胞嘧啶抗體，37℃孵育1 h，洗板同上，并進(jìn)行顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

測(cè)序結(jié)果的甲基化水平計(jì)算：ML=mC/(mC+umC)。其中，ML 為甲基化水平，mC 和umC 分別代表覆蓋區(qū)域甲基化C 位點(diǎn)和未甲基化C 位點(diǎn)的read數(shù)目。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)。運(yùn)用SPSS 19.0 軟件對(duì)各個(gè)組的甲基化水平進(jìn)行ANOVA 分析和Duncan 多重比較，獲得兩兩之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

ELISA 測(cè)定DNA 甲基化水平，通過(guò)制備陰性對(duì)照(100 ng/μl)和陽(yáng)性對(duì)照(100 ng/μl)的混合物來(lái)制備已知5-mC 不同百分比的(5%、10%、25%、50%、75%和100%)標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到各個(gè)樣品的整體甲基化水平。

2 結(jié)果

2.1 不同處理下刺參消化道DNA 甲基化模式分析

由全基因組DNA 甲基化測(cè)序(WGBS)結(jié)果(表1)可知，刺參消化道組織的常溫對(duì)照組T20 基因組的甲基化位點(diǎn)數(shù)為5050974 個(gè)，T26 組的基因組甲基化位點(diǎn)數(shù)為5315261，T32 組基因組的甲基化位點(diǎn)數(shù)為4714193 個(gè)。在所有的處理組和對(duì)照組中，CpG(簡(jiǎn)寫CG)類型甲基化位點(diǎn)數(shù)目為4563209～5134931，也有一定數(shù)量的甲基化胞嘧啶發(fā)生在 CHH 位點(diǎn)(116612～141870)，而CHG 類型甲基化位點(diǎn)相對(duì)較少(34372～42059)。

T20、T26 和T32 溫度組的全基因組總甲基化水平分別為(1.70±0.01)%、(1.79±0.11)%和(1.59±0.04%)(表2)，T26 組基因組的總甲基化水平表現(xiàn)為上升，T32組基因組的總甲基化水平表現(xiàn)為下降，且低于T20組，方差分析表明，T26 組的總甲基化水平和T32 組存在顯著差異(P＜0.05)。對(duì)不同類型的甲基化來(lái)說(shuō)，C 堿基甲基化水平表現(xiàn)出與總甲基化水平一致的趨勢(shì)，T26 組CG 類型C 堿基甲基化水平較T20 升高，而T32 組較T26 組降低，且差異顯著(P＜0.05)。在2種非CG 類型的甲基化模式中，CHG 類型T20 組與T32 組存在顯著差異(P＜0.05)，CHH 類型中3 組差異不大，且都呈現(xiàn)低甲基化的變異模式。大部分DNA甲基化發(fā)生在CG 類型的C 堿基上，CG 類型的C 堿基DNA 甲基化程度為13.32%～14.99%，顯示中等的DNA 甲基化水平。

表1 甲基化位點(diǎn)數(shù)目及類型Tab.1 Number and type statistics of methylation sites

表2 不同溫度下刺參全基因組甲基化水平Tab.2 The methylation levels of C bases of Apostichopus japonicus at different temperature (%)

對(duì)3 個(gè)溫度下CG、CHH 和CHG 位點(diǎn)甲基化與總體甲基化占比情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖1。mCG 類型甲基化百分比均在96%以上，mCHH 類型甲基化百分比在T20、T26 和T26 組樣品分別為2.79%、2.42%和2.57%，mCHG 類型甲基化百分比最少，均在1%以下。

根據(jù)測(cè)得的甲基化比例，統(tǒng)計(jì)不同甲基化水平的甲基化位點(diǎn)中3 種類型占各自類型的百分比可以看出(圖2)，在甲基化水平為30%時(shí)，處于這一水平的CHG 和CHH 甲基化位點(diǎn)分別占本類型的30%左右，為最高點(diǎn)，且顯著高于CG 類型，之后隨著位點(diǎn)甲基化水平的增高，其所占百分比下降；而隨著甲基化位點(diǎn)甲基化水平的增高，CG 類型的百分比總體呈明顯的增高趨勢(shì)，在甲基化水平為100%時(shí)，占比達(dá)到該類型的最高點(diǎn)。

圖1 不同溫度條件下甲基化C 位點(diǎn)的數(shù)量及其占總甲基化C 位點(diǎn)的比例Fig.1 The number of methylated C sites and their proportion to the total methylated C sites in different sequence environments

圖2 所有樣本甲基化位點(diǎn)水平分布Fig.2 The level distribution of methylation sites in all samples

2.2 不同溫度下刺參組織間甲基化水平比較

采用5-mC DNA ELISA Kit 試劑盒檢測(cè)不同溫度條件下刺參的呼吸樹、消化道、縱肌和體壁4 種組織的基因組的甲基化水平，并進(jìn)行不同組間方差分析。數(shù)據(jù)顯示，在3 種不同溫度下，刺參呼吸樹和消化道組織的甲基化水平范圍為(2.68±0.10)%～(3.29±0.06)%，均高于縱肌和體壁組織，其中，體壁的甲基化水平在(2.05±0.15)%～(2.11±0.11)%之間，縱肌的甲基化水平最低，為(1.68±0.07)%～(1.76±0.03)%。各組織的總甲基化水平從高到低依次為呼吸樹＞消化道＞體壁＞縱肌(圖3)。不同溫度對(duì)刺參組織的甲基化水平有所改變，T26 組刺參樣品消化道和呼吸樹組織的甲基化水平顯著高于T20 對(duì)照組(P＜0.05)，T32 組刺參樣品消化道和呼吸樹組織的甲基化水平又顯著低于T26 對(duì)照組(P＜0.05)。呼吸樹和消化道組織的甲基化水平總體呈一致趨勢(shì)，在溫度從20℃升至26℃時(shí)，甲基化水平升高，而溫度繼續(xù)升至32℃時(shí)，甲基化水平下降；而縱肌和體壁組在3 個(gè)溫度下的甲基化水平各組間均無(wú)顯著差異。

圖3 不同溫度下5-mC 甲基化試劑盒檢測(cè)各組織DNA 甲基化水平變化Fig.3 Using 5-mC methylation kit to detect tissues DNA methylation levels under different experimental conditions

3 討論

3.1 不同溫度對(duì)刺參基因組DNA 甲基化的影響

研究結(jié)果表明，DNA 甲基化參與了海洋動(dòng)物環(huán)境脅迫適應(yīng)性機(jī)制，諸如鹽度(環(huán)朋朋, 2018)、重金屬(周新文等, 2001)、溫度(侯艷雯等, 2019; 王藝雅,2015)等環(huán)境因子的逆境脅迫下，甲基化會(huì)有明顯差異。Flores 等(2013)提出，環(huán)境誘導(dǎo)影響DNA 甲基化的變異，可能通過(guò)增加基因組被標(biāo)記區(qū)域的突變性，改變生物的表型，使其適應(yīng)自然選擇。溫度一直是影響水產(chǎn)動(dòng)物生存的重要因素，在不同溫度條件下，基因組內(nèi)的甲基化變異能夠通過(guò)改變某些特定功能基因DNA 甲基化狀態(tài)來(lái)影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)脅迫響應(yīng)機(jī)制等來(lái)提高動(dòng)物的耐寒性或耐熱性。朱華平等(2013)分析了耐寒羅非魚(Oreochroms mossambcus)與正常組基因組DNA 甲基化的差別，結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)DNA 總甲基化下降，同時(shí)主要發(fā)生去甲基化過(guò)程。吳彪等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝受到急性升溫脅迫處理后，基因組DNA 總甲基化率下降。王翠麗(2019)研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫過(guò)程中，近江牡蠣(Ostrea rivular is)的核心啟動(dòng)子甲基化水平與Hsp90 基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。孔寧(2016)研究發(fā)現(xiàn)，在溫度、鹽度脅迫下，皺紋盤鮑(Haliotis discus)的表觀遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，調(diào)控相關(guān)抗逆基因表達(dá)。這些研究結(jié)果均表明，溫度變化可誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物基因或組織的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變。

本研究通過(guò)WGBS 和ELISA 對(duì)刺參消化道等組織甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同溫度下刺參組織中的甲基化水平有所改變，刺參消化道組織和呼吸樹組織的T26 組甲基化水平最高。刺參在26℃養(yǎng)殖環(huán)境下處于夏眠或生理代謝活動(dòng)較弱的狀態(tài)，這期間刺參消化、呼吸等生理代謝活動(dòng)調(diào)節(jié)減弱(Gao et a l,2008)。處于休眠狀態(tài)的T26 組刺參基因組甲基化水平的增高，一定程度上說(shuō)明刺參這些組織中的一些功能基因受到甲基化調(diào)節(jié)而表達(dá)水平下降，相應(yīng)地，減弱其參與調(diào)控的生理代謝活動(dòng)來(lái)維持刺參的休眠狀態(tài)。刺參消化道組織和呼吸樹組織的T32 組甲基化水平較T26 組降低。32℃是對(duì)刺參生命活動(dòng)產(chǎn)生危害的脅迫溫度，在這個(gè)溫度下，刺參會(huì)發(fā)生系列應(yīng)激反應(yīng)以自我保護(hù)，生理反應(yīng)和活動(dòng)變化意味著刺參體內(nèi)需要啟動(dòng)一系列轉(zhuǎn)錄表達(dá)和調(diào)控，而甲基化水平的降低調(diào)節(jié)可能起重要作用。

3.2 刺參基因組甲基化模式

DNA 甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，主要有3 種類型：CG、CHG 和CHH。在動(dòng)物中，胞嘧啶的甲基化多發(fā)生于CpG 二核苷酸序列中，CG 是主要甲基化修飾類型，非CG 類型的序列(CHH 和CHG)在基因中十分少見(Cokus et al, 2008; Zhang et al,2015)。脊椎動(dòng)物通常存在于基因間區(qū)和富含重復(fù)序列的區(qū)域，而在無(wú)脊椎動(dòng)物中，DNA 甲基化主要發(fā)生于基因內(nèi)部，基因間區(qū)大部分未被甲基化(Schaefer et al, 2010)。在胚胎干細(xì)胞研究(Lister et al, 2009)中，CHG 和CHH 型的甲基化位點(diǎn)分別占17.3%和7.2%，Sun 等(2014)檢測(cè)到櫛孔扇貝(Chlamys fa rreri)基因組中，分別有14.9%～16.5%的CpG 類型和5.1%～6.3%的CHG 類型的甲基化位點(diǎn)。不同溫度條件下的刺參消化道DNA 樣品經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽處理后，進(jìn)行WGBS測(cè)序分析，甲基化位點(diǎn)類型分析顯示，在所有甲基化胞嘧啶(mCs)中，有超過(guò)96%的CpGs，且CG 類型的C 堿基呈現(xiàn)中等甲基化水平(24.11%～24.48%)，CHG 和CHH 類型的C 堿基呈現(xiàn)低甲基化水平(0.49%～0.56%)。

在不同溫度刺參甲基化模式的對(duì)比分析中，3 個(gè)溫度組消化道的總甲基化率和CG 類型C 堿基甲基化水平之間存在顯著差異(P＜0.05)，T26 組消化道高于T20 和T32 組，CHG 和CHH 類型的C 堿基甲基化水平在2 組之間差異不顯著(P＞0.05)。已研究的大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物表現(xiàn)出鑲嵌式的甲基化模式，無(wú)論是在無(wú)脊椎動(dòng)物，還是脊椎動(dòng)物，基因內(nèi)CpG 甲基化的功能都是保守的，它能夠抑制基因內(nèi)部異常轉(zhuǎn)錄的起始(Suzuki et al, 2007)。目前，非CG 類型的甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系尚不清楚，值得更深入的研究。

3.3 組織間的甲基化差異分析

不同組織間的基因組甲基化水平的差異是生物界普遍存在的現(xiàn)象。在水產(chǎn)動(dòng)物的不同組織間甲基化研究中，杜盈等(2013)利用MSAP 技術(shù)分析野生組中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus c hinensis)和選育品種“黃海1 號(hào)”的甲基化水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生組中國(guó)明對(duì)蝦的縱肌和鰓組織甲基化水平差異極顯著(P＜0.05)，而二者與血液組織的甲基化水平差異極顯著(P＜0.01)；“黃海1 號(hào)”的鰓組織和血液組織甲基化水平相近，都極顯著低于縱肌組織(P＜0.01)。羅少杰(2017)運(yùn)用甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)馬氏珠母貝(Phyllostachys mo llissima)的邊緣膜區(qū)、套膜區(qū)和中央膜區(qū)的基因組甲基化水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)各組織甲基化水平具有顯著性差異，其中，中央膜區(qū)的甲基化水平最高[(19.04±2.55)%]。這些結(jié)果顯示，無(wú)脊椎動(dòng)物不同組織間甲基化水平存在差異，可能是由于DNA 甲基化在細(xì)胞分化以及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用(Sun et al, 2014; 何暮春等, 2018)。果蠅(Drosophilid)、水蚤(Daphnia magna)、牡蠣(C. gigas)等部分無(wú)脊椎動(dòng)物的甲基化研究發(fā)現(xiàn)，其基因組甲基化處于較低水平(Regev et al, 1998; Riviere et al,2013; Hearn et al, 2019)。本研究結(jié)果表明，刺參在不同溫度水體中，不同組織 DNA 總甲基化水平在1%～4%之間，并呈現(xiàn)呼吸樹、消化道、體壁、縱肌的甲基化程度依次降低的趨勢(shì)。由于技術(shù)原因，通過(guò)WGBS 和ELISA 方法測(cè)得的消化道甲基化水平存在差異，但總體屬于基因組甲基化水平較低的無(wú)脊椎動(dòng)物類型。在同一溫度下，刺參的不同組織間甲基化水平存在明顯差異，且隨著溫度的升高，縱肌和體壁組織甲基化水平基本不變，而呼吸樹和消化道組織的甲基化水平總體趨勢(shì)一致，在溫度從20℃升至26℃時(shí)，甲基化水平顯著升高，而在溫度繼續(xù)升至32℃時(shí)，甲基化水平顯著下降。曹哲明等(2009)認(rèn)為，DNA 甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的方式，甲基化程度高的組織相對(duì)來(lái)說(shuō)基因表達(dá)水平較低。在升溫過(guò)程中，消化道的基因表達(dá)程度最低，說(shuō)明不同組織對(duì)溫度變化的敏感性不同，這與之前的研究結(jié)果相符。刺參經(jīng)歷高溫休眠時(shí)期，呼吸代謝和攝食效率發(fā)生改變，作為這一過(guò)程主要的功能器官——消化道和呼吸樹受到的影響最大，同時(shí)會(huì)發(fā)生不同程度的退化和萎縮(Zhao et al, 2015)。

4 總結(jié)

本研究對(duì)高溫脅迫下刺參基因組DNA 甲基化的變化情況進(jìn)行了探究。相較于生活在正常水溫的個(gè)體，經(jīng)歷不同溫度處理的刺參的表觀基因組發(fā)生顯著性改變，使得相關(guān)基因表達(dá)或抑制。目前，動(dòng)物在環(huán)境溫度脅迫下，全基因組范圍內(nèi)的去甲基化過(guò)程和甲基化的協(xié)調(diào)機(jī)制，以及動(dòng)物表型的形成和環(huán)境適應(yīng)性的表觀遺傳機(jī)制，都值得關(guān)注。未來(lái)研究應(yīng)該更多關(guān)注全基因組表觀變化啟動(dòng)的分子機(jī)制，例如，DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)抑制的調(diào)控作用；以及關(guān)注動(dòng)物中表觀遺傳變異與物種表型差異、環(huán)境適應(yīng)如何相互聯(lián)系。表觀遺傳學(xué)在環(huán)境脅迫中的作用和機(jī)制尚有諸多問(wèn)題需進(jìn)一步探討。