黑牛肝菌多糖超聲提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

景年華 史俊友 田照秀 成琴

摘要：以云南大理黑牛肝菌為材料，使用超聲輔助萃取及水提醇沉法提取多糖，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)黑牛肝菌多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)黑牛肝菌多糖進(jìn)行了提取;對(duì)所得多糖進(jìn)行DPPH自由基、ABTS自由基清除能力及鐵氰化鉀還原能力試驗(yàn)，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，黑牛肝菌多糖最佳提取工藝為料液比1∶25（g∶mL）、醇沉濃度80%、超聲時(shí)間70min、超聲功率90%，在此條件下多糖含量為79.41mg/g。醇沉濃度為80%時(shí)，多糖提取物抗氧化活性最強(qiáng)，多糖對(duì)DPPH、ABTS自由基清除率及總還原力吸光度分別為97.92%、99.80%和0.789;醇沉濃度為50%時(shí)，所得多糖對(duì)DPPH、ABTS自由基清除率及總還原力吸光度分別為85.79%、88.23%和0.713，抗氧化活性最低;表明黑牛肝菌多糖對(duì)自由基有較好的清除效果及還原作用。

關(guān)鍵詞：黑牛肝菌;多糖;超聲波輔助萃取;工藝優(yōu)化;抗氧化活性

中圖分類號(hào)R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2021）08-0170-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.045

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

StudyonOptimizationofUltrasonicExtractionProcessandAntioxidantofPolysaccharidesfromBoletusaereus

JINGNian-hua，SHIJun-you，TIANZhao-xiuetal（QujingNormalUniversity，Qujing，Yunnan655011）

AbstractWithDaliBoletusaereusasthematerial，thepolysaccharidewasextractedbyultrasonic-assistedextractionandwaterextractionandalcoholprecipitation.SinglefactortestandorthogonaltestwereusedtooptimizetheextractionprocessofBoletusaereuspolysaccharides，andthepolysaccharidesofBoletusaereuswereextracted.Additionally，acomparativestudyonscavengingabilitiesofDPPH，ABTSandreducingpowerofpotassiumferricyanidefortheobtainedpolysaccharideswascarriedout.TheresultsshowedthatthebestextractiontechnologyofpolysaccharidesfromBoletusaereuswasthesolid-liquidratio1∶25（g∶mL），ethanolconcentrationof80%，ultrasonictimeof70minandultrasonicpowerof90%.ContentofpolysaccharideobtainedfromBoletusaereuswas79.41mg/gunderthebestextractionconditions.Antioxidantactivityofpolysaccharideprecipitatedby80%ethanolwasthestrongest，scavengingratesofDPPH，ABTSandabsorbanceoftotalreducingpowerwere97.92%，99.80%and0.789respectively.Antioxidantactivityofpolysaccharideprecipitatedby50%ethanolwasthelowest，scavengingratesofDPPH，ABTSandabsorbanceoftotalreducingpowerwere85.79%，88.23%and0.713，respectively.TheseresultsshowedthatpolysaccharidesfromBoletusaereushadgoodscavengingabilityandreducingpower.

KeywordsBoletusaereus;Polysaccharides;Ultrasonicassistedextraction;Processoptimization;Antioxidantactivity

牛肝菌是菌物界中比較大型的擔(dān)子菌重要代表[1]，屬擔(dān)子菌亞門擔(dān)子菌綱牛肝菌目牛肝菌科牛肝菌屬，下有11～20屬。中國牛肝菌科有400多種，其中有毒不可食用的牛肝菌約30多種，大多數(shù)無毒無苦辣無刺激味的種類均可食用[2]。牛肝菌是一種山區(qū)特有的野生菌類，主要生長(zhǎng)于混交林中[3]，一般單生或群生，云南省是牛肝菌的主要分布地區(qū)，目前已知牛肝菌244種，其中可食用牛肝菌144種[4]，醫(yī)學(xué)上認(rèn)為牛肝菌食藥同源，食藥兼有，是一種能同時(shí)藥用和食用的野生菌資源，含有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，因此具有較好的開發(fā)和利用價(jià)值[5]。黑牛肝菌又名銅色牛肝菌，是一種低脂肪、低熱量、高蛋白的食藥兩用野生真菌，相關(guān)報(bào)道較少[6]。

多糖是天然大分子物質(zhì)，在動(dòng)物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁及高等植物中均有分布[7]。大量研究數(shù)據(jù)表明，多糖在生物體中具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、致突變以及免疫調(diào)節(jié)等功能[8]。真菌多糖具有多種藥理活性，對(duì)人體有顯著的保健功效。自由基具有強(qiáng)氧化活性，長(zhǎng)期存在于機(jī)體中會(huì)對(duì)免疫能力有所損壞，而多糖在自由基清除中扮演著較為重要的角色，對(duì)自由基有良好的清除效果。牛肝菌多糖作為牛肝菌多種藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，主要含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等，對(duì)自由基清除效果明顯，具有很強(qiáng)的抗氧化活性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，牛肝菌多糖具有多種生物活性及功能，如調(diào)節(jié)免疫活性、降血脂、抗突變、抗感染、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等[9-10]。因此，研究牛肝菌多糖無論在食品領(lǐng)域還是醫(yī)藥領(lǐng)域均具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，目前對(duì)于牛肝菌多糖的提取多集中于傳統(tǒng)熱水法[5，11-13]，但該法存在能耗大、耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低等缺點(diǎn)?；诖耍撛囼?yàn)以云南大理黑牛肝菌為主要原料，使用超聲波輔助萃取和水提醇沉法提取多糖，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)黑牛肝菌多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)黑牛肝菌多糖進(jìn)行提取;同時(shí)對(duì)所得多糖進(jìn)行DPPH自由基、ABTS自由基清除能力及鐵氰化鉀還原能力試驗(yàn)，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑黑牛肝菌產(chǎn)自云南大理州，試驗(yàn)備用。DPPH（分析純，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）、ABTS（分析純，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）及其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備小型高速粉碎機(jī)（WK-600A），青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司;紫外-可見分光光度計(jì)（TU1810PC），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA），上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9101-3），金壇市杰瑞爾電器有限公司;循環(huán)水式真空泵（SHZ-（Ⅲ）），上海標(biāo)和儀器有限公司;超聲波清洗器（SK3200LHC），上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;電子分析天平（CP214），上海奧豪斯儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋（XMTD-204），上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī)（80-2），上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司;優(yōu)普系列超純水儀（UPH-IV-20T），成都超純科技有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1超聲輔助提取黑牛肝菌多糖。黑牛肝菌子實(shí)體烘干粉碎，精確稱取5.0000g已粉碎牛肝菌，加入一定量蒸餾水，超聲波輔助提取一定時(shí)間，提取結(jié)束后，4000r/min離心15min，取上清液抽濾，得樣品提取液。

1.3.2黑牛肝菌多糖含量測(cè)定。

1.3.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密移取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60mL于具塞比色管里，移取適量蒸餾水補(bǔ)足體積至2mL，搖勻，繼續(xù)加入1mL6%苯酚溶液后，向具塞比色管中迅速加入5mL濃硫酸，充分振蕩搖勻后，室溫下放置顯色20min，以零號(hào)管作為空白對(duì)照，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2多糖含量測(cè)定。黑牛肝菌多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[14-15]，試驗(yàn)步驟與“1.3.2.1”葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制一致，測(cè)定樣品吸光度，將此數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黑牛肝菌多糖含量（mg/g）。

1.3.3單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取牛肝菌粉末5.0000g，以水為提取溶液進(jìn)行單因素試驗(yàn)。選取料液比、超聲提取時(shí)間、超聲功率及醇沉濃度4個(gè)影響牛肝菌多糖提取的因素，以牛肝菌多糖含量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。料液比為1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45（g∶mL）;超聲時(shí)間為30、40、50、60、70min;超聲功率為60%、70%、80%、90%、100%;醇（乙醇）沉濃度為50%、60%、70%、80%、90%。

1.3.4正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）和醇沉濃度（D）為參考因素，以多糖含量為考察指標(biāo)，采用L9（43）正交表（表1），進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)超聲提取牛肝菌多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳提取工藝條件。

1.3.5黑牛肝菌多糖抗氧化活性試驗(yàn)。

1.3.5.1黑牛肝菌多糖提取。依據(jù)正交試驗(yàn)所得最佳提取工藝條件提取黑牛肝菌多糖，烘干至恒重。

1.3.5.2DPPH自由基清除能力測(cè)定。參照許效群等[16-17]試驗(yàn)方法，并稍作修改。準(zhǔn)確移取2.00mL不同濃度多糖溶液于具塞比色管中，向比色管中依次加入2.00mL0.06mg/LDPPH溶液，置于暗處反應(yīng)30min，于517nm處測(cè)定其吸光度，平行測(cè)定3次，計(jì)算清除率。

1.3.5.3ABTS自由基清除能力測(cè)定。取7mmol/LABTS溶液5.00mL，加入88μL140mmol/L過硫酸鉀，室溫下置于暗處反應(yīng)12～16h。用甲醇稀釋該溶液，于734nm處測(cè)定其吸光度，約為0.7，得ABTS自由基溶液。參照李帆等[18-19]試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)步驟稍作修改，準(zhǔn)確移取0.50mL不同濃度多糖溶液于具塞比色管中，向比色管中依次加入4.50mLABTS自由基溶液，于37℃水浴10min后，于734nm處測(cè)定其吸光度，平行測(cè)定3次，計(jì)算其清除率。

1.3.5.4還原力測(cè)定。參照吳海濤等[20]的鐵氰化鉀還原法并稍作修改，準(zhǔn)確吸取1.00mL不同濃度多糖溶液于具塞比色管中，依次加入0.1mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液各2.00mL，充分混勻，于50℃水浴20min后，向比色管中加入2.00mL10%三氯乙酸溶液，振蕩混合后，靜置15min。取上清液2.00mL，依次加入2.00mL水和1.00mL0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10min后反應(yīng)溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色，于700nm處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照以蒸餾水代替樣品，平行測(cè)定3次。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得出線性回歸方程為y=8.007x-0.006（R2=0.9990），試驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖含量為0.02～0.14mg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1料液比對(duì)黑牛肝菌多糖提取的影響。從圖2可以看出，料液比為1∶5～1∶25時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，多糖含量逐漸升高，這是因?yàn)檎麴s水用量增加，使得多糖充分溶解，提取含量升高，而料液比為1∶25～1∶45時(shí)，隨著提取溶劑的增加，多糖含量稍微下降，這可能是因?yàn)殡S著蒸餾水的增加，黑牛肝菌中其他的親水性物質(zhì)也大量溶解，使得多糖溶解量降低[21]。由此可知，黑牛肝菌多糖提取時(shí)，試驗(yàn)最佳料液比為1∶25，此時(shí)黑牛肝菌多糖提取效果較好。

2.2.2超聲時(shí)間對(duì)黑牛肝菌多糖提取的影響。從圖3可以看出，超聲時(shí)間為30～60min時(shí)，隨著超聲時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，多糖含量逐漸升高，這是因?yàn)槌晻r(shí)間越長(zhǎng)，黑牛肝菌細(xì)胞破碎越為徹底，多糖溶出量增加，提取含量升高;而超聲時(shí)間為70min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖含量稍微下降，這可能是因?yàn)闀r(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步破碎導(dǎo)致雜質(zhì)的溶出相應(yīng)增多，使得多糖的溶出量降低，另外超聲有較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間會(huì)使大分子多糖斷裂，降低黑牛肝菌多糖的提取率[21]。由此可知，黑牛肝菌多糖提取時(shí)，試驗(yàn)最佳超聲時(shí)間為60min，此時(shí)黑牛肝菌多糖提取效果較好。

2.2.3超聲功率對(duì)黑牛肝菌多糖提取的影響。從圖4可以看出，超聲功率為60%～100%時(shí)，隨著超聲功率的增大，多糖含量逐漸升高，這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間固定，超聲波的破碎作用主要取決于超聲功率，超聲功率越大，對(duì)細(xì)胞的破碎作用越強(qiáng)，多糖溶出量增加，提取含量升高。而超聲功率為80%～100%時(shí)，隨著超聲功率逐漸增大，多糖含量增幅不大，這可能是因?yàn)槌暪β蔬^大時(shí)，提取液的流動(dòng)加速，減少了黑牛肝菌在超聲場(chǎng)中的停留時(shí)間而導(dǎo)致細(xì)胞破碎減弱，從而導(dǎo)致多糖含量增幅不大。因此，黑牛肝菌多糖提取時(shí)，試驗(yàn)最佳超聲功率為80%，此時(shí)黑牛肝菌多糖提取效果較好。

2.2.4醇沉濃度對(duì)黑牛肝菌多糖提取的影響。從圖5可以看出，醇沉濃度為50%～90%時(shí)，隨著醇沉濃度的增大，多糖含量逐漸升高，這是因?yàn)?0%、90%乙醇的極性更接近于多糖的極性，增加了牛肝菌多糖的溶解從而提高多糖提取量;而醇沉濃度為90%時(shí)，相比較醇沉濃度為80%時(shí)，多糖含量無顯著上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著醇沉濃度的增加，含水量相對(duì)減少所導(dǎo)致的結(jié)果。因此，黑牛肝菌多糖提取時(shí)，試驗(yàn)最佳醇沉濃度為80%，此時(shí)黑牛肝菌多糖提取效果較好。

2.3正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）、醇沉濃度（D）為參考因素，以多糖含量為考察指標(biāo)，采用L9（43）進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)超聲提取牛肝菌多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，其試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對(duì)黑牛肝菌多糖提取含量的影響程度從大到小依次為A、D、C、B，即料液比的影響程度最大，其次是醇沉濃度和超聲功率，超聲時(shí)間的影響程度最小;以黑牛肝菌多糖含量為考察指標(biāo)的最佳提取條件為A1B3C3D2，即料液比1∶25、超聲時(shí)間70min、超聲功率90%、醇沉濃度80%;在此條件下，提取黑牛肝菌多糖以進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，所得多糖含量為79.41mg/g（n=3），此數(shù)值均大于正交試驗(yàn)各試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.4黑牛肝菌多糖抗氧化活性研究

2.4.1不同醇沉濃度黑牛肝菌多糖對(duì)DPPH自由基清除能力比較。從圖6可以看出，多糖濃度為0.5～3.5g/L時(shí)，不同醇沉濃度所得多糖溶液對(duì)DPPH自由基清除效果隨濃度增大，清除率明顯上升。當(dāng)多糖濃度為3.5～5.5g/L時(shí)，多糖溶液對(duì)DPPH自由基清除效果逐漸趨于平緩，此時(shí)醇沉濃度為80%時(shí)，所得多糖對(duì)DPPH自由基清除效果最好，清除率可達(dá)97.92%;醇沉濃度為50%時(shí)，DPPH自由基清除效果較弱，清除率為85.79%。多糖濃度為0.5～2.0g/L時(shí)，醇沉濃度為90%時(shí)，多糖對(duì)DPPH自由基清除效果較其他醇沉濃度多糖效果明顯。不同醇沉濃度所得多糖對(duì)DPPH自由基清除效果隨濃度的增加而增強(qiáng)，后續(xù)趨于平緩。醇沉濃度為50%時(shí)，所得多糖清除率為21.24%～85.79%;醇沉濃度為60%時(shí)，所得多糖清除率為27.71%～96.49%;醇沉濃度為70%時(shí)，所得多糖清除率為27.48%～96.77%;醇沉濃度為80%時(shí)，所得多糖清除率為34.99%～97.92%;醇沉濃度為90%時(shí)，所得多糖清除率為38.56%～90.64%。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度均為5.5g/L時(shí)，醇沉濃度為60%、70%和80%時(shí)，黑牛肝菌多糖對(duì)DPPH自由基清除效果接近，清除率分別是96.47%、96.77%、97.92%。試驗(yàn)結(jié)果顯示黑牛肝菌多糖對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。

2.4.2不同醇沉濃度黑牛肝菌多糖對(duì)ABTS自由基清除能力比較。從圖7可以看出，多糖濃度為0.5～4.0g/L時(shí)，不同醇沉濃度所得多糖溶液對(duì)ABTS自由基的清除效果明顯上升;多糖濃度為4.0～5.5g/L時(shí)，多糖溶液對(duì)ABTS自由基清除效果逐漸趨于平緩。醇沉濃度為50%時(shí)，黑牛肝菌多糖溶液清除率為29.87%～88.23%;醇沉濃度為60%時(shí)，多糖溶液清除率為29.42%～96.99%;醇沉濃度為70%時(shí)，多糖溶液清除率為31.77%～95.54%;醇沉濃度為80%時(shí)，多糖溶液清除率為37.91%～99.80%;醇沉濃度為90%時(shí)，多糖溶液清除率為35.80%～98.34%。不同醇沉溶度所得黑牛肝菌多糖溶液對(duì)ABTS自由基清除效果為80%>90%>60%>70%>50%。試驗(yàn)結(jié)果顯示牛肝菌多糖對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力。

2.4.3不同醇沉濃度黑牛肝菌多糖還原力比較。從圖8可以看出，多糖濃度為2～10g/L時(shí)，不同醇沉濃度所得多糖溶液對(duì)鐵氰化鉀的還原能力明顯增強(qiáng)，多糖濃度為10～12g/L時(shí)，不同醇沉濃度所得多糖溶液對(duì)鐵氰化鉀的還原能力趨于平緩。多糖濃度為12g/L時(shí)，80%醇沉濃度所得多糖對(duì)鐵氰化鉀的還原能力最強(qiáng)，吸光度為0.789，醇沉濃度50%所得多糖對(duì)鐵氰化鉀的還原能力較弱，吸光度為0.713。不同醇沉濃度所得多糖溶液對(duì)鐵氰化鉀的還原能力均隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，然后趨于平緩。由圖8可知不同醇沉濃度所得多糖對(duì)鐵氰化鉀的還原能力不同，80%醇沉濃度所得多糖最強(qiáng)，其次為60%醇沉濃度所得多糖。試驗(yàn)結(jié)果顯示牛肝菌多糖對(duì)鐵氰化鉀具有較強(qiáng)的還原能力。

3結(jié)論

該試驗(yàn)以黑牛肝菌為原料，采用超聲波輔助提取，通過單因素及正交試驗(yàn)得黑牛肝菌多糖提取工藝條件，其最佳提取工藝條件為料液比1∶25、超聲時(shí)間70min、超聲功率90%、醇沉濃度為80%，在該提取工藝條件下，對(duì)黑牛肝菌多糖進(jìn)行提取，得多糖含量為79.41mg/g。以料液比1∶25、超聲時(shí)間70min、超聲功率90%對(duì)黑牛肝菌多糖進(jìn)行提取，選用不同醇沉濃度對(duì)糖提取液進(jìn)行沉淀，對(duì)所得多糖的抗氧化活性進(jìn)行了比較研究。根據(jù)結(jié)果綜合來看，當(dāng)醇沉濃度為80%時(shí)，多糖提取物抗氧化活性最強(qiáng)，多糖對(duì)DPPH、ABTS自由基清除率及總還原力吸光度分別可達(dá)97.92%、99.80%和0.789;醇沉濃度為50%時(shí)，所得多糖對(duì)DPPH、ABTS自由基清除率及總還原力吸光度分別為85.79%、88.23%和0.713，抗氧化活性最低。結(jié)果表明黑牛肝菌多糖對(duì)自由基有較好的清除能力及還原作用。

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