青刺果內(nèi)生真菌PUR-01的分離?鑒定及抗性評(píng)價(jià)

鄭鵬 張玥 寇燦

摘要 從青刺果植株中首次分離得到菌株P(guān)UR-01，并對(duì)其進(jìn)行分離純化、抗性評(píng)價(jià)、形態(tài)學(xué)分析及分子生物學(xué)鑒定，探討該菌株對(duì)2種熱帶作物病原真菌的抑菌活性研究。結(jié)果表明，青刺果內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.Cubense，F(xiàn)oc）均有一定的抑制作用，抑菌率分別為34%和24%，為進(jìn)一步開展該菌株生防作用機(jī)理及應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，該菌為鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌。

關(guān)鍵詞 青刺果;內(nèi)生真菌;分離;鑒定;抗性評(píng)價(jià);橡膠樹膠孢炭疽病菌;香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；?/p>

中圖分類號(hào) Q93文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）08-0005-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Isolation，Identification and Resistance Evaluation of Endophytic Fungi PUR-01 from Prinsepia utilis Royle

ZHENG Peng，ZHANG Yue，KOU Can （Lijiang Teachers College，Lijiang，Yunnan 674100）

Abstract The strain PUR-01 was isolated for the first time from the Prinsepia utilis Royle plant，and it was isolated and purified，resistance evaluation，morphological analysis and molecular biological identification were carried out to explore the antibacterial activity of this strain against two tropical crop pathogenic fungi.The result showed that the endophytic fungi PUR-01 had certain inhibitory effects on Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，the inhibition rates were 34% and 24%，respectively.It provided the basis for research on biocontrol mechanism and application of endophytic fungi.By morphological and molecular biological identification，the strain was caused by Alternaria alternata.

Key words Prinsepia utilis Royle; Endophytic fungi;Isolation;Identification;Resistance evaluation;Colletotrichum gloeosporioides;Fusarium oxysporum f.sp.Cubense

青刺果（Prinsepia utilis Royle）為薔薇科扁核木屬（Prinsepia Royle）多年生落葉灌木[1]。青刺果果仁可以榨油，青刺果油中不飽和脂肪酸的含量較高[2]，符合人體代謝的生理需求，是一種綠色健康的食用油;另外，青刺果油與皮膚之間有良好的親和性，因此，青刺果油是一種重要的天然護(hù)膚油脂[3]。

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物出現(xiàn)明顯感染病害的真菌[4]。一些植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌一方面可以提供植物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一方面可以提高宿主植物的抗病性、應(yīng)對(duì)逆境環(huán)境，并可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)[5-7]。截至目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)青刺果內(nèi)生真菌的相關(guān)研究尚屬空白，該研究從青刺果莖段及葉片中分離出對(duì)2種熱帶作物重要植物病原真菌具有一定抑菌活性及耐鹽特性的內(nèi)生真菌PUR-01。因青刺果全株均可入藥，并具有活性、祛瘀、接骨消腫等功效，青刺果油還對(duì)防止高血壓、治療糖尿病、防止心血管疾病都有較好的效果[3]，因此，研究青刺果內(nèi)生真菌具有十分重要的意義。該研究旨在為今后進(jìn)一步開發(fā)利用青刺果內(nèi)生菌資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，F(xiàn)oc），均由麗江師范高等專科學(xué)校提供。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）用于內(nèi)生真菌的分離、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）用于內(nèi)生真菌液體發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 青刺果內(nèi)生真菌的分離和純化。選取新鮮健康青刺果葉片和莖段，將青刺果葉、莖段用流水沖洗1 h，晾干放入干凈的燒杯中，用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，再用0.5%新潔爾滅溶液浸泡20 min，無菌水沖洗3次，最后一次沖洗的無菌水留下備用。用無菌濾紙將青刺果葉片和莖段水分吸干后，加10 mL無菌水進(jìn)行研磨，取1 mL左右的研磨液涂布在PDA平板上，靜止2 min，隨后倒置放于28 ℃培養(yǎng)。待觀察到平板上菌落長(zhǎng)出，采用平板劃線法進(jìn)行分離和純化。直至得到純菌株并將其接種到斜面PDA培養(yǎng)基上，液體石蠟密封并于4 ℃進(jìn)行保存。

消毒可靠性設(shè)置：①將最后一次沖洗材料的無菌水1 mL涂布到PDA平板上，靜止2 min，倒置放于相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察結(jié)果。②參照組織印跡法[8]，將滅菌好的青刺果葉片、莖段各1片壓入PDA平板內(nèi)，使滅菌材料與PDA培養(yǎng)基密切接觸30 min后，移去葉片和莖段。倒置于28 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01抑菌活性初篩及復(fù)篩。

1.2.2.1 內(nèi)生真菌抑菌活性初篩。將內(nèi)生真菌PUR-01、供試菌株活化后，用打孔器分別打出菌餅（0.9 cm×0.9 cm），在無菌條件下，將內(nèi)生真菌PUR-01菌餅接種于培養(yǎng)皿中央，供試菌株橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.Cubense，F(xiàn)oc）分別接種于青刺果內(nèi)生真菌PUR-01兩側(cè)，間隔2～3 cm，每個(gè)培養(yǎng)皿接種相同的供試菌株2塊，置于28℃培養(yǎng)7 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2.2 內(nèi)生真菌抑菌活性復(fù)篩。在無菌條件下用接種針挑取青刺果內(nèi)生真菌 PUR-01 少量菌絲接種于100mL發(fā)酵液（PDB培養(yǎng)基）中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件設(shè)置：搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為恒溫25 ℃，時(shí)間為6 d。

待PDA培養(yǎng)基溫度降低至50～60 ℃時(shí)，將上述1mL發(fā)酵濾液與9mL融化的 PDA 培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成平板。待培養(yǎng)基凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)基平板上接入1個(gè)供試菌株菌餅（直徑為9 mm），使帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，將平板置于25℃培養(yǎng)72 h。以無菌水為對(duì)照，每處理 3 次重復(fù)，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率[9]：菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]×100%。

1.2.3 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01形態(tài)學(xué)鑒定。參照載玻片培養(yǎng)觀察法[10]。

1.2.4 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法。

挑取青刺果內(nèi)生真菌 PUR-01 少量菌落接種于20 mL PDB培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)5 d。真菌DNA根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取，真菌ITS序列PCR擴(kuò)增使用通用引物 ITS1和ITS4（ITS1：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′; ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（multiple alignments），并用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01分離純化

通過可靠性檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)有菌落長(zhǎng)出。說明該試驗(yàn)對(duì)青刺果外植體的消毒是徹底的。通過培養(yǎng)，從含有研磨液的PDA平板上用平板劃線法不斷分離、純化，最終獲得青刺果內(nèi)生真菌PUR-01。

2.2 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01抑菌活性初篩及復(fù)篩

以平板對(duì)峙法初步檢測(cè)青刺果內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)供試2種熱帶作物病原真菌菌株的抑菌活性，從圖1可以看出，青刺果內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)供試的香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；鸵志钚暂^為明顯，而對(duì)橡膠樹膠孢炭疽病菌抑菌活性不明顯;結(jié)果表明，青刺果內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)供試的香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；途哂忻黠@的拮抗性。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)青刺果內(nèi)生真菌PUR-01的抑菌活性，采用菌絲生長(zhǎng)速率法[9]進(jìn)行復(fù)篩，從表1可以看出，青刺果內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)橡膠樹膠孢炭疽病菌和香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；偷囊种坡史謩e為34%、24%，由此可知，青刺果內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)2種熱帶作物病原真菌都具有一定的抑菌活性，但抑菌活性均比較低。

2.3 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01形態(tài)學(xué)鑒定

從圖2可以看出，青刺果內(nèi)生真菌PUR-01菌落表面為絨狀，圓形，黑色至灰色，同心輪紋。菌落背面黑色至灰色?；鶅?nèi)菌絲發(fā)達(dá)，有隔，菌絲單生或分枝。分生孢子鏈生，卵形或長(zhǎng)橢圓形，黃褐色，分子孢子橫隔膜3～6個(gè)，縱或斜隔膜0～2個(gè)，短喙柱狀。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[11]，將青刺果內(nèi)生真菌PUR-01初步鑒定為鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌。

2.4 青刺果內(nèi)生真菌PUR-01分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 通過18S rDNA的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物純化后送上海生物工程公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入到NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，采用MEGA 6.06軟件用Neighbour-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置如下：Bootstrap method重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000;Gaps/Missing Data Treatment 采用Pairwise deletion模型，得到圖3。從圖3可以看出，該菌的ITS序列和Alternaria alternata strain（基因登錄號(hào)KR912224.1）、Alternaria alternata strain（基因登錄號(hào)KX783397.1）聚為一簇，結(jié)合該菌的形態(tài)特征，認(rèn)為該菌為半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科、鏈格孢屬（Alternaria alternata）。

3 討論與結(jié)論

青刺果作為一種特殊的油料植物越來越受到麗江市人民政府的重視，青刺果因其全株可以入藥一直被納西族所利用，其嫩尖還可以泡茶或做涼拌菜。研究表明，青刺果多糖對(duì)糖尿病小鼠肝臟具有保護(hù)作用[12];青刺果種粕粉乙酸乙酯提取物通過柱層析后抑菌活性大大提高[13]，青刺果油還具有調(diào)節(jié)血脂、抑制血小板聚集、抗氧化、護(hù)膚等作用[14-18]。目前，研究藥用植物內(nèi)生真菌并從中發(fā)現(xiàn)具有活性成分和結(jié)構(gòu)新穎的化合物已成為研究熱點(diǎn)[19-21]。青刺果作為一種兼藥用和食用的特殊植株，對(duì)其內(nèi)生真菌的分離及應(yīng)用存在空白。該試驗(yàn)通過對(duì)青刺果內(nèi)生真菌的分離，并用2種重要熱帶作物病害為病原指示菌，發(fā)現(xiàn)分離的內(nèi)生真菌PUR-01對(duì)2種供試菌具有一定的抑菌活性但抑菌活性都不強(qiáng);通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，該菌為鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌，這也是首次從青刺果莖葉中分離到的真菌。鏈格孢屬（Alternaria alternata）真菌是一種常見的可引起作物病害的病原菌，在全球分布最廣，95%以上的種類都兼性寄生在植物上，為潛在的病原菌[22-24]。此外，鏈格孢屬真菌也是一類具有開發(fā)潛力的生物資源，其代謝產(chǎn)物具有殺蟲、殺菌的作用，能夠提高植物自身免疫力，對(duì)多種植物病害有較高的防效[25]。

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