林 龍,葛程程,蔣建東,錢國良*
(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,南京 210095;2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210095)
產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenes OH11屬黃單胞科Xanthomonadaceae、溶桿菌屬Lysobacter,是一種對多種植物病原卵菌和真菌有很強拮抗作用的生防細菌[1]。產(chǎn)酶溶桿菌無鞭毛,在自然生境中依賴于細胞表面附著的IV型菌毛(Type IV pilus)進行蹭行運動[2-4]。通過這種獨特的運動方式,菌株OH11可以接近并附著在絲狀病原真菌和卵菌的菌絲上[5,6],進而利用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶等多種胞外水解酶和 HSAF(Heat-Stable Antifungal Factor)等次級代謝產(chǎn)物酶消解菌絲[7-9],抑制病原菌的生長。在這個過程中,溶桿菌的基因表達需要受到精確的時空調(diào)控以完成向病原菌的運動和攻擊。轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到基因的啟動子區(qū)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)家族轉(zhuǎn)錄因子是細菌中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族,其可以通過HTH功能域結(jié)合DNA,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[10],其中LysR(transcriptional activator of lysine biosynthesis)和GntR(gluconate operon transcriptional repressor)兩類轉(zhuǎn)錄因子在細菌中得到廣泛的研究,在黃單孢菌Xanthomonas中可以調(diào)控細菌的代謝、運動性、致病性等多種生理學(xué)功能[11-14]。
在前期研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶溶桿菌OH11的LysR家族轉(zhuǎn)錄因子LysRLe是4-羥基苯甲酸(4-HBA)的受體,4-HBA可以增強LysRLe與HSAF合成關(guān)鍵基因lafB啟動子區(qū)的結(jié)合,從而促進HSAF的合成[15]。產(chǎn)酶溶桿菌OH11中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子是否參與運動性的調(diào)控還沒有得到研究。在大豆斑疹病菌Xanthomonas axonopodis pv. glycines中LyR家族轉(zhuǎn)錄因子LcrX可以調(diào)控其游動性、生物膜形成、致病性等過程[12]。推測產(chǎn)酶溶桿菌中可能存在可以調(diào)控運動性的LysR轉(zhuǎn)錄因子,因此在OH11的基因組中隨機選取3個LysR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1404、Le2114和Le3293的編碼基因進行研究。
GntR家族轉(zhuǎn)錄因子在產(chǎn)酶溶桿菌中的功能尚未報道。在野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris中GntR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR1在侵染過程中正調(diào)控了III型分泌系統(tǒng)致病基因的表達,是誘導(dǎo)植物過敏反應(yīng)和致病性所必需的[11]。在柑橘黃單胞菌Xanthomonas citri中GntR家族轉(zhuǎn)錄因子YtrA調(diào)控了III型分泌系統(tǒng)、運動性、對寄主的黏附力、胞外酶的產(chǎn)生等過程,并且是其致病必需的[14]。為了探究產(chǎn)酶溶桿菌中GntR轉(zhuǎn)錄因子是否有類似的功能,從OH11的基因組中隨機選取2個GntR家族轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因Le2114和Le1155進行研究。
本研究利用同源重組的方法對3個LysR家族蛋白(Le1404、Le2114和Le3293)以及2個GntR蛋白(Le1155和Le1310)的編碼基因進行敲除,通過一系列表型分析,解析這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控產(chǎn)酶溶桿菌OH11蹭行運動和HSAF合成中的作用。
大腸桿菌和產(chǎn)酶溶桿菌OH11均使用LB(Luria Broth)液體培養(yǎng)基培養(yǎng),其中大腸桿菌適用于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)。菌株OH11及其衍生菌株為本實驗室保存,適用于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)。抗生素:卡那霉素(Km 100 μg/mL或30 μg/mL,適用于OH11)、慶大霉素(Gm 25 μg/mL適用于大腸桿菌;Gm 150 μg/mL,適用于OH11)。100% TSB培養(yǎng)基:稱取Trypic Soy Broth(Sigma)30 g,加入ddH2O攪拌溶解至總?cè)萘繛? L。10% TSB培養(yǎng)基:稱取Trypic Soy Broth 3.0 g,加入ddH2O攪拌溶解至總?cè)萘繛? L。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基:稱取10 g幾丁質(zhì)加入約100 mL HCl后攪拌直至呈黏稠的糊狀物,過濾后于4 ℃靜置,每隔12 h棄上清,直至pH約為7.0。稱取0.7 g K2HPO4、0.3 g KH2PO4、0.5 g MgSO4、0.01 g Fe2(SO4)3、0.001 g ZnSO4、0.5 g酵母提取物加入400 mL溶解后的幾丁質(zhì),加入ddH2O定容至1 L。
參考OH11全基因組,所有引物用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(表1),均由金唯智生物技術(shù)有限公司提供。
表1 本試驗中所使用的引物Table 1 Primers used in this study
DNA的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及感受態(tài)的制備等操作參見文獻[16]。
用滅菌牙簽挑取8個通過電擊轉(zhuǎn)化而得到的一次交換子轉(zhuǎn)接到1 mL LB中,28 ℃、220 r/min培養(yǎng)3 h;取100 μL菌液涂布于含10%蔗糖和100 μg/mL Km抗生素的LB平板上,28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2~3 d,此步驟目的是去除一次交換子,陽性轉(zhuǎn)化子染色體上整合進pEX18GM載體,該載體上的sacB基因是一個反向篩選標記基因,陽性一次轉(zhuǎn)化子在含有蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長;一次交換轉(zhuǎn)化子在沒有抗生素等培養(yǎng)基中生長時,能夠通過等位基因同源重組發(fā)生第二次交換,進而pEX18GM載體離開染色體,即產(chǎn)生目的基因缺失突變體或野生型菌株;將得到的雙交換子分別在LB+Km+Gm和LB+Km平板上劃線,選擇可以在LB+Km平板上生長同時不能在LB+Km+Gm平板上生長的交換子,然后通過PCR驗證缺失突變體的準確性。
挑取單菌落于LB中,28 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按2%的接種量轉(zhuǎn)接至10% TSB中,28 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h(OD600nm=1.0)。取1 mL菌液至離心管中,6000 r/min離心3 min,加入ddH2O懸浮菌體,調(diào)整OD600nm等于1.0。吸取2 μL菌液,分別滴在10% TSB、100% TSB、LB平板上,每個處理重復(fù)3次,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后觀察結(jié)果。
挑取待測單菌落于LB中,28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng);1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB中,28 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h;吸取8 mL菌液于50 mL離心管中,12000 r/min離心5 min,棄去上清,將菌體沉淀轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中,加入750 μL甲醇,劇烈振蕩直至所有菌體裂解,然后在通風(fēng)廚內(nèi)加入750 μL的氯仿,吹打至充分混勻;12000 r/min離心10 min,取有機相于新的2 mL離心管中,用酶標儀OD445nm測定。
挑取單菌落于LB中,28 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按2%的比例轉(zhuǎn)接至10% TSB中,28 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600nm=1.0。將濾紙平鋪在培養(yǎng)皿中,均勻加入1 mL的滅菌水浸濕濾紙。吸取1 mL融化好的5% TSB固體培養(yǎng)基平鋪于載玻片上,凝固待用。取1 mL菌液于空的培養(yǎng)皿中,用燒過的鑷子夾取蓋玻片,用蓋玻片的一邊沾取少許菌液后輕放于5% TSB的載玻片上。每個處理重復(fù)3次。置于28 ℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)24 h后,顯微鏡下觀察。
HSAF的提?。禾羧〈郎y單菌落接種到LB中,28 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按照1%比例轉(zhuǎn)接到10% TSB中,28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取3 mL菌液于長玻璃管中,加入12 μL濃鹽酸和3 mL乙酸乙酯,固定好管口,28 ℃、220 r/min培養(yǎng)3 h。吸取2 mL上清至2 mL離心管,放置通風(fēng)櫥中吹干。風(fēng)干后加入200 μL甲醇溶解,離心并過濾。
HPLC檢測:流動相A、B分別為H2O(0.005 mol/L TFA)、CH3CN(0.005 mol/L TFA)。HPLC的檢測參數(shù)如表2所示,檢測波長為318 nm。
表2 HSAF的HPLC檢測參數(shù)Table 2 Parameter of HPLC for HSAF detection
挑取待檢測單菌落接種到LB中,28 ℃,220 r/min培養(yǎng)至OD600nm=1.0。取2 mL菌液,6000 r/min離心3 min,棄去上清,加入ddH2O懸浮菌體,調(diào)整OD600nm=1.0。將2 μL待測菌液點在幾丁質(zhì)酶篩選平板上,設(shè)置陽性對照(OH11),每組3個重復(fù),置于28 ℃恒溫箱倒置避光培養(yǎng)3~5 d。
本研究在OH11基因組中選取了3個LysR家族蛋白(Le1404、Le2114和Le3293)以及2個GntR蛋白(Le1155和Le1310),利用SMART網(wǎng)站進行功能域分析(表3)。利用染色體同源重組的方法獲得LysR家族的3個突變體ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293和GntR家族的2個突變體ΔLe1155、ΔLe1310(表4)。
表3 LysR蛋白和GntR蛋白功能域分析Table 3 Functional domain analysis of LysR and GntR proteins
表4 突變體PCR驗證Table 4 The PCR of mutants
對突變體菌落形態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)突變體ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310、ΔLe1155的菌落形態(tài)均與OH11無顯著差異。菌落在LB、10% TSB、100% TSB培養(yǎng)基平板上均呈圓形。在LB培養(yǎng)基平板上菌落為黃色,光滑透亮;在10% TSB培養(yǎng)基平板上菌落為白色,濕潤透亮,可看見菌落邊緣的圓形暈圈;在100% TSA培養(yǎng)基平板上菌落為白色,較為干燥(圖1)。
圖1 突變體的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony observation of mutants
黃色素能夠保護細菌免受紫外線和氧化的傷害,在細菌生長過程中也起著重要作用[17],對這5個突變體的黃色素產(chǎn)量進行測定。按照1.6節(jié)方法提取黃色素,使用酶標儀檢測OD445nm,得到結(jié)果如圖2所示,ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310、ΔLe1155突變體與 OH11相比,黃色素產(chǎn)量接近一致,且無顯著差異。
圖2 突變體黃色素產(chǎn)量檢測Fig. 2 Yellow pigment production detection of mutants
產(chǎn)酶溶桿菌在環(huán)境中需要依靠蹭行運動接近病原菌,從而進行進一步攻擊[6]。用蓋玻片沾取OD600nm=1的菌液,輕放在5% TSB固體培養(yǎng)基上,靜置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,用顯微鏡觀察蹭行運動。如圖3所示,OH11野生型菌液向一側(cè)擴散,邊緣有大量運動開來的單個桿狀菌體,并且有清晰可見的運動軌跡;ΔLe1404、ΔLe3293、ΔLe1310突變體運動狀態(tài)與OH11相似,并未影響OH11的蹭行運動;突變體ΔLe2114、ΔLe1155菌液邊緣未見運動菌體,無向外擴散的痕跡,喪失了蹭行運動能力。
圖3 ΔLe2114和ΔLe1155菌株蹭行運動出現(xiàn)缺陷Fig. 3 ΔLe2114 and ΔLe1155 showed defect in twitching motility
HSAF具有廣譜的抗真菌活性,是OH11中重要的生防因子[9],因此對突變體HSAF的產(chǎn)量進行檢測。首先提取OH11與突變體的HSAF,接著使用高效液相色譜(HPLC)檢測HSAF產(chǎn)量,并利用統(tǒng)計學(xué)軟件分析,得到如圖4所示結(jié)果,ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310突變體的HSAF產(chǎn)量與OH11相比無顯著差異,ΔLe1155的HSAF產(chǎn)量有明顯下降趨勢。
圖4 Le1155突變導(dǎo)致OH11的HSAF產(chǎn)量下降Fig. 4 Mutation of Le1155 led to HSAF biosynthesis reduction in OH11
OH11可以分泌幾丁質(zhì)酶瓦解病原真菌的細胞壁[18],基于其重要的生防功能,對這五個突變體的幾丁質(zhì)酶活性進行鑒定。經(jīng)過在幾丁質(zhì)板上的點板試驗,試驗結(jié)果顯示OH11與ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310、ΔLe1155突變體均能在菌落周圍的幾丁質(zhì)板上形成明顯的降解圈,如圖 5所示,表明突變體并未喪失幾丁質(zhì)酶分泌能力。
圖5 突變體幾丁質(zhì)酶活性檢測Fig. 5 Chitinase activity detection of mutants
利用同源重組的方法,我們獲得產(chǎn)酶溶桿菌OH11 Le1404、Le2114、Le3293、Le1310、Le1155共5個基因的敲除突變體,發(fā)現(xiàn)Le2114和Le1155的突變顯著抑制了OH11的蹭行運動,說明這2個基因可能參與了蹭行運動的調(diào)控;同時ΔLe1155的HSAF產(chǎn)量顯著下降,說明Le1155可能參與了HSAF合成的調(diào)控。這5個基因的突變均不影響菌落形態(tài)、黃色素產(chǎn)生、纖維素酶的合成,說明Le2114和Le1155對相應(yīng)表型的調(diào)控具有特異性。
溶桿菌沒有鞭毛,依靠IV型菌毛介導(dǎo)的蹭行運動進行移動,從而接近并攻擊病原真菌[4],因此蹭行運動是產(chǎn)酶溶桿菌的關(guān)鍵生防因子。產(chǎn)酶溶桿菌的IV型菌毛的組裝需要菌毛蛋白、ATP酶、內(nèi)膜蛋白、外膜蛋白、處理菌毛蛋白前體的前導(dǎo)肽酶等一系列蛋白[4],這些蛋白的表達受到精密的調(diào)控,如菌毛調(diào)控蛋白PilR可以結(jié)合菌毛蛋白基因pilA的啟動子區(qū),調(diào)控菌毛蛋白的合成[19]。產(chǎn)酶溶桿菌OH11中的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clp可以直接結(jié)合到pilA基因和pilMONOPQ操縱子的啟動子區(qū),調(diào)控菌毛的合成[20]。我們發(fā)現(xiàn)LysR家族轉(zhuǎn)錄因子Le2114和GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1155都可以調(diào)控蹭行運動,這兩個蛋白是否是可以直接結(jié)合菌毛組裝相關(guān)蛋白啟動子區(qū),調(diào)控菌毛的組裝還有待進一步研究。
產(chǎn)酶溶桿菌合成的HSAF是一種重要的生防代謝物,其合成是由一個包含10個基因的基因簇完成的,這個基因簇形成一個操縱子,由一個啟動子(pHSAF)調(diào)控基因簇的表達[21]。HSAF的合成受到多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如Clp、LysRLe、LetR、LarR[15,21-23]等。同時轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控HSAF的過程中存在相互作用,如LysRLe是4-HBA的受體并且正調(diào)控larR的轉(zhuǎn)錄,而4-HBA負調(diào)控larR的轉(zhuǎn)錄,LysRLe和LarR均正調(diào)控HSAF的合成[23]。我們發(fā)現(xiàn)GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1155同樣可以調(diào)控HSAF的合成,Le1155能否直接結(jié)合pHSAF,Le1155調(diào)控HSAF的過程是否與其他轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)還有待進一步研究。
本研究通過基因敲除和表型分析首次報道了產(chǎn)酶溶桿菌OH11中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子Le2114可以調(diào)控蹭行運動,GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1155可以調(diào)控蹭行運動和HSAF的合成,這些結(jié)果為進一步研究溶桿菌蹭行運動和HSAF合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的線索,同時也為從遺傳上獲得高運動性及HSAF高產(chǎn)菌株,提高產(chǎn)酶溶桿菌生防菌劑的防效提供理論基礎(chǔ)。