脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層粉末用于大鼠脾部分切除創(chuàng)面止血的研究

王文平，張文紅，杜茂濤，張弘沛，龔 慧，朱宇軒，李世榮，田 怡

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形美容科，重慶 400010;2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容科，重慶 400038)

快速有效的止血方法在創(chuàng)傷急救和外科手術(shù)中都非常重要。除了常規(guī)止血方法(壓迫止血、結(jié)扎止血、電凝止血)，局部外用止血藥物也提供了新的止血策略。局部外用止血藥物按照其凝血機(jī)制可分為兩大類：一類是接觸后主動(dòng)啟動(dòng)生物體內(nèi)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)形成纖維蛋白凝塊產(chǎn)生凝血作用；另一類是通過接觸、活化促進(jìn)血小板聚集而產(chǎn)生被動(dòng)凝血作用[1]。局部外用止血藥物已廣泛應(yīng)用于整形外科、泌尿外科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域，減少了醫(yī)療資源和血液制品的浪費(fèi)[2-6]。

理想的止血材料應(yīng)具備以下特征：止血迅速，具有生物相容性及可降解性，無細(xì)胞毒性，無免疫原性，不增加感染概率，不影響組織愈合，易于消毒，成本低且易于獲得[7]。目前使用的局部止血藥物有多種類型，如纖維素類、纖維蛋白、凝血酶、殼聚糖、明膠海綿類，但都各有利弊。因此，迫切需要開發(fā)易于獲取、安全、有效、實(shí)用和低成本的新型止血材料。

脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)是異種來源、不含細(xì)胞成分、生物相容性好、在體內(nèi)可降解的生物材料。SIS主要是由膠原、糖胺聚糖構(gòu)成，富含生長因子，已成功用于多種臨床治療，包括硬腦膜移植、疝氣修復(fù)、腹壁重建以及腎腫瘤腎部分切除術(shù)后的尿漏及創(chuàng)面出血[8]。鑒于SIS的優(yōu)點(diǎn)及廣泛運(yùn)用，本研究將脫細(xì)胞處理的SIS經(jīng)凍干后粉碎制成粉末，用于大鼠脾部分切除創(chuàng)面止血，以觀察其止血效果。

1 材料與方法

1.1 脫細(xì)胞SIS粉末制備[9]

取新鮮豬小腸，用刮匙刮除漿膜層和肌層獲得黏膜下層，清洗后用甲醇和氯仿(體積比1∶1)浸泡12 h脫脂；去離子水漂洗3次后，用0.05%胰酶、0.05%EDTA室溫下消化12 h脫細(xì)胞；去離子水沖洗3次，于含0.5%SDS的生理鹽水中振蕩4 h，生理鹽水沖洗3次；0.5%醋酸浸泡過夜，打漿機(jī)粉碎后加入胃蛋白酶，室溫下酶解2 d后過濾；濾液經(jīng)2次鹽析離心后取沉淀，將沉淀溶解于0.1%醋酸中，8KD透析袋透析24 h；透析后的液體經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干后粉碎成粉末(圖1)，消毒后保存于無菌容器內(nèi)，4 ℃冰箱密閉保存。

1.2 SIS的DNA殘留及SIS粉末吸水性檢測

凍干處理的SIS膜進(jìn)行HE染色，以觀察脫細(xì)胞后的細(xì)胞殘留情況。稱重并記錄篩網(wǎng)的重量(篩孔大小200目)為M0；將SIS粉末(0.5 g)放入篩網(wǎng)中，然后浸入水槽，在不同的時(shí)間點(diǎn)(5 s、10 s、15 s、20 s、40 s、60 s、120 s)從水中取出篩網(wǎng)，紗布吸出殘留水分后稱重，記為Mt。同樣方法檢測福和泰止血粉(青島頤中生物工程有限公司)、瞬時(shí)止血粉(山東賽克賽斯藥業(yè)科技有限公司)的吸水率作為對(duì)照。吸水率=(Mt-M0-0.5)/0.5×100%。

a:脫細(xì)胞脫脂凍干等處理后的SIS;b:機(jī)械粉碎后獲得的SIS粉末

1.3 大鼠脾部分切除創(chuàng)面的止血

將40只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為A組(SIS粉末)、B組(福和泰止血粉)、C組(瞬時(shí)止血粉)、D組(無菌紗布?jí)浩?，每組10只。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉，仰臥固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒后切開腹部，將脾完全暴露，紗布吸出腹腔和脾表面的液體，在脾末端沿短軸方向，用剪刀剪去約0.5 cm的脾組織，紗布清除表面流血，建立脾出血模型[10]。按照分組將止血粉末噴于創(chuàng)面，然后將脾置于無菌紗布上，觀察傷口的出血情況，直到出血停止；D組用無菌紗布?jí)浩戎钡匠鲅Ｖ?。記錄出血時(shí)間和出血量(脾放置在紗布前后的重量差)。5-0尼龍線縫合腹部切口，并用抗生素藥膏保護(hù)其免受感染。

1.4 掃描電鏡觀察止血粉及其用于創(chuàng)面后的結(jié)構(gòu)

3種止血材料用于創(chuàng)面10 min后，取下帶有止血材料的脾組織置于戊二醛固定24 h，經(jīng)過洗滌、脫水、噴金等處理后在掃描電鏡下觀察其表面以及在脾表面的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 使用止血粉后脾創(chuàng)面組織學(xué)觀察

術(shù)后第20天、30天，每組處死5只大鼠。切開腹部，觀察止血粉在脾創(chuàng)面上的吸收情況。然后將組織取下用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋并切片進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察脾的創(chuàng)面情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 脫細(xì)胞后SIS細(xì)胞殘留及吸水性檢測

HE染色結(jié)果顯示脫細(xì)胞處理后SIS中無細(xì)胞成分殘留(圖2a)。SIS粉末、福和泰止血粉和瞬時(shí)止血粉均具有很強(qiáng)的吸水能力。福和泰止血粉與水接觸后迅速溶解形成凝膠狀牢固地黏附在篩板上，不再吸收水分;瞬時(shí)止血粉在前10 s內(nèi)迅速吸水，在15 s時(shí)，吸水率達(dá)到飽和(1 176.87±47.21)%;SIS粉末的吸水性在前10 s內(nèi)弱于瞬時(shí)止血粉，在15 s時(shí)已具備和瞬時(shí)止血粉相同的吸水率，并在120 s時(shí)達(dá)到飽和(2 289.18±26.46)%，是瞬時(shí)止血粉的1.87倍;重量相同的3種粉末，SIS粉末的吸水率顯著高于福和泰止血粉和瞬時(shí)止血粉(圖2b)。

2.2 使用止血粉后創(chuàng)面情況

A組SIS粉末噴灑在出血?jiǎng)?chuàng)面上，逐漸從血液中吸收水分并濃縮血液中的固體成分(血小板、紅細(xì)胞、凝血因子和纖維蛋白)，SIS粉末相互接觸形成機(jī)械屏障封閉創(chuàng)面，出血逐漸停止，止血效果徹底；B組福和泰止血粉噴在出血?jiǎng)?chuàng)面后立即溶解，形成牢固的凝膠狀薄膜黏附在創(chuàng)面上，出血逐漸停止；C組瞬時(shí)止血粉與B組相似；D組壓迫5 min后，傷口仍有少量出血，用紗布持續(xù)壓迫傷口后，血流量逐漸減少，最終出血停止。第20天時(shí)，A、B、C組創(chuàng)面均可看到未吸收完的止血粉末；第30天時(shí)，創(chuàng)面上的止血粉末較第20天時(shí)明顯減少，福和泰止血粉基本已完全被吸收完，SIS粉末的吸收較福和泰止血粉、瞬時(shí)止血粉慢(圖3)。

a:SIS脫細(xì)胞處理后HE染色;b:3種止血粉末的吸水率比較 *：與SIS粉末比較，P<0.01

圖3 止血粉末用于創(chuàng)面當(dāng)時(shí)及第20天、30天的止血情況(紅色箭頭所示為未吸收的止血粉末)

2.3 出血時(shí)間及出血量

A組、B組和C組的出血時(shí)間和出血量均短/少于D組，A組的出血時(shí)間和出血量短/少于C組，A組的出血時(shí)間短于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.4 掃描電鏡結(jié)果

鏡下見SIS粉末呈單層的長薄片狀，福和泰止血粉呈細(xì)長的纖維狀，瞬時(shí)止血粉呈大小不均的圓球狀(圖4)。脾凝血塊樣品鏡下見SIS粉末相互接觸形成膜狀的機(jī)械屏障，同時(shí)血液中的成分(如凝血因子、血小板、纖維蛋白和紅細(xì)胞)聚集在SIS的表面上，加速了內(nèi)源性凝血機(jī)制。

表1 各組出血時(shí)間及出血量比較

2.5 使用止血粉后脾組織的一般觀察和組織學(xué)評(píng)價(jià)

A組第20天時(shí)可觀察到相對(duì)多的SIS粉末，第30天時(shí)創(chuàng)面上SIS粉末逐漸減少，明顯少于第20天時(shí)；B組大部分止血粉在第20天被吸收，在第30天基本被完全吸收；C組第20天時(shí)可見大量未吸收完的止血粉末，第30天時(shí)創(chuàng)面可見少量未吸收的止血粉末，見圖5。

a～c：3種止血粉末的結(jié)構(gòu)；d～f：3種止血粉末在創(chuàng)面上參與止血時(shí)的結(jié)構(gòu)

圖5 HE染色觀察止血粉末的吸收情況(黑色箭頭所示為未吸收完的止血粉末)

3 討論

在外科手術(shù)過程中，毛細(xì)血管或小靜脈彌漫性、持續(xù)性的出血會(huì)引起很多問題，術(shù)中使用高效的局部止血?jiǎng)┠軌虮３质中g(shù)視野清晰，減少輸血，縮短手術(shù)時(shí)間，降低并發(fā)癥的發(fā)生率等[11-12]。優(yōu)質(zhì)的止血藥物在外科手術(shù)中起著關(guān)鍵作用，目前可供選擇的局部止血?jiǎng)┯卸喾N類型，如纖維素類、纖維蛋白、凝血酶、明膠海綿類等。其中纖維素類(如復(fù)合微孔多聚糖蛋白)的止血效果非常好，但由于其成本較高，臨床應(yīng)用受限；纖維蛋白和凝血酶有可能引起免疫反應(yīng)和輸血傳播性疾??；動(dòng)物來源的膠原蛋白，尤其是牛來源的膠原蛋白，容易產(chǎn)生免疫反應(yīng)；明膠海綿類止血藥物有導(dǎo)致膿腫和肉芽腫的風(fēng)險(xiǎn)。目前國內(nèi)可吸收止血材料行業(yè)相對(duì)來說基礎(chǔ)薄弱，技術(shù)研發(fā)能力偏低，產(chǎn)品質(zhì)量較低，與國外差距大，且止血材料研究領(lǐng)域落后于其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，很少有重大進(jìn)展，臨床所用多為經(jīng)典材料。因此，急需開發(fā)易于獲取、安全、有效、體內(nèi)可降解、實(shí)用和低成本的止血材料。

本研究探索了SIS粉末作為止血材料應(yīng)用于大鼠脾部分切除創(chuàng)面止血的情況，結(jié)果顯示，經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的SIS膜不含有細(xì)胞成分，無DNA殘留，不會(huì)引起免疫反應(yīng)。另外，由于止血?jiǎng)╅L時(shí)間黏附于創(chuàng)面會(huì)引起組織炎癥反應(yīng)，而本研究組織學(xué)檢測結(jié)果顯示，SIS粉末、福和泰止血粉和瞬時(shí)止血粉都可以在1個(gè)月左右降解完。說明脫細(xì)胞SIS粉末對(duì)機(jī)體來說是比較安全可靠的。

本研究吸水性能檢測結(jié)果顯示，福和泰止血粉吸水后形成凝膠狀，吸水性能有限；瞬時(shí)止血粉吸水迅速；SIS粉末的吸水性在15 s時(shí)可達(dá)到與瞬時(shí)止血粉相同的吸水率，隨后還能繼續(xù)吸水，最大吸水率是瞬時(shí)止血粉的1.87倍。掃描電鏡結(jié)果顯示SIS粉末的止血機(jī)制與瞬時(shí)止血粉相似。SIS粉末噴灑到創(chuàng)面后相互連接形成一個(gè)膜狀的機(jī)械屏障，同時(shí)迅速吸收血液中的液體成分，濃縮血液中的血小板、紅細(xì)胞、凝血因子、纖維蛋白，啟動(dòng)內(nèi)外源性凝血過程，加速凝血。相比于福和泰止血粉和瞬時(shí)止血粉，SIS粉末的止血效果更佳，更具優(yōu)勢。

SIS是異種來源的生物材料，經(jīng)過加工處理后去除細(xì)胞成分，在生物體內(nèi)具有良好的生物相容性，并且可以在體內(nèi)降解，已成功用于許多臨床治療。但是也有研究指出，在處理過程中若DNA不能完全去除時(shí)會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，在進(jìn)行脫脂脫細(xì)胞處理時(shí)可以適當(dāng)延長處理時(shí)間并反復(fù)漂洗，盡量去除DNA。本研究也存在一定的局限性，只在大鼠脾出血進(jìn)行止血研究，未在大型動(dòng)物創(chuàng)面或臟器出血進(jìn)一步研究以模擬人體出血止血情況，對(duì)于SIS粉末的止血效果及止血的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上，SIS粉末在體內(nèi)可降解，具有極強(qiáng)的吸水性。SIS粉末作為止血?jiǎng)诖笫笃⒉糠智谐齽?chuàng)面具有良好的止血作用，應(yīng)用前景廣闊。