TRESK介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

王文康 李恒昌 陳廷鳳

廣州市第一人民醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510180

有研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及發(fā)展與谷氨酸及其受體相關(guān)，脊髓中的谷氨酸受體與感覺相關(guān)[1-3]。TRESK介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生有關(guān)[4-6]，現(xiàn)研究TRESK介導(dǎo)的mTOR信號(hào)通路對(duì)SD大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。且研究認(rèn)為谷氨酸作為誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞與機(jī)體發(fā)生慢性疼痛具有相關(guān)性[7-8]，本研究于2018年1月至2020年1月就TRESK介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路對(duì)SD大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行討論，報(bào)道如下。

1 材料及方法

1.1 SD大鼠脊髓原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃無(wú)菌環(huán)境中，將新生不超過(guò)24 h的SD大鼠（性別不限，體重5～6 g，廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）脊髓分離并剪碎，以0.25%的胰蛋白酶（上海晶抗生物工程有限公司，JLC2128）制成單細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過(guò)濾、離心、沉淀、稀釋后于經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的24孔板（美國(guó)Sigma公司）進(jìn)行接種。24 h后更換為飼養(yǎng)培養(yǎng)液。4 d后加入4 μg/ml的阿糖胞苷（美國(guó)Sigma公司），處理2 d后，將阿糖胞苷更換為無(wú)阿糖胞苷（美國(guó)Sigma公司），7 d后進(jìn)行相關(guān)因子的測(cè)量。

1.2 方法

100例SD大鼠的脊髓原代神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為4組，每組各25例。A組采用TRESK siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以最終濃度為20 nmol /L的mTOR特異性抑制劑進(jìn)行預(yù)處理20 min，再使用100 μmol /L的谷氨酸進(jìn)行24 h處理；B組用20 nmol /L的mTOR特異性抑制劑預(yù)處理后，進(jìn)行24 h的100 μmol /L谷氨酸處理；D組僅使用100 μmol /L的谷氨酸進(jìn)行24 h處理；C組不進(jìn)行任何處理。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 脊髓神經(jīng)元cleaved Caspase3、Bax水平的測(cè)定 用Western blot法來(lái)測(cè)定Caspase3、Bax的水平，抗體來(lái)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3.2 脊髓神經(jīng)元活力的測(cè)定 采用EL-311酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）對(duì)光密度進(jìn)行測(cè)定，以光密度值反映脊髓神經(jīng)元的活力。

1.3.3 脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）對(duì)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率進(jìn)行分析。

1.3.4 脊髓神經(jīng)元mTOR磷酸化水平的測(cè)定 采用ECL試劑盒（廣州吉賽生物科技有限公司）進(jìn)行顯色反應(yīng)后暗室內(nèi)X線片曝光顯影。磷酸化mTOR比總mTOR蛋白積分光密度值的值反映mTOR磷酸化的水平。

1.3.5 脊髓神經(jīng)元TRESK mRNA表達(dá) 脊髓神經(jīng)元進(jìn)行PCR處理后采取熔解曲線實(shí)驗(yàn)，從60 ℃升溫至95 ℃。采用 2－ΔΔCt法對(duì)相對(duì)定量進(jìn)行分析，計(jì)算出TRESK mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間的計(jì)量資料用（）表示，采用方差分析，計(jì)量資料的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組脊髓神經(jīng)元凋亡蛋白比較

四組在脊髓神經(jīng)元凋亡蛋白上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（P＜ 0.05）；A組、B組、D組 的 cleaved Caspase3和Bax水平均高于C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組的 cleaved Caspase3和Bax水平最高，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組脊髓神經(jīng)元凋亡蛋白比較（）

表1 各組脊髓神經(jīng)元凋亡蛋白比較（）

注：cleaved Caspase3：#與 C 組 比 較，qA=25.845，P ＜ 0.001，qB=50.013，P ＜ 0.001，qD=32.173，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA=23.660，P＜ 0.001，qD=27.845，P＜ 0.001；△ 與 D 組 比 較，qA=2.600，P ＜ 0.05。Bax：#與 C組比較，qA =16.029，P＜0.001，qB =36.987，P ＜ 0.001，qD =42.989，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA =10.348，P＜0.001，qD =17.556，P＜0.001；△與 D組比較，qA=5.252，P＜0.001

組別 cleaved Caspase3 Bax A組（n=25） 2.17±0.20#*△ 0.51±0.07#*△B組（n=25） 3.76±0.27#△ 0.73±0.08#△C 組（n=25） 0.88±0.10 0.12±0.02 D 組（n=25） 2.04±0.15#* 0.43±0.03#*F值 963.291 506.019 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 各組脊髓神經(jīng)元活力及脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較

四組在脊髓神經(jīng)元活力及脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組的脊髓神經(jīng)元活力最高，脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率最低，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組的脊髓神經(jīng)元活力最差，脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率最高，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組脊髓神經(jīng)元活力及脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較（）

注：脊髓神經(jīng)元活力：#與C組比較，qA=12.582，P＜0.001，qB=18.027，P ＜ 0.001，qD=11.036，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA=11.057，P＜ 0.001，qD=16.144，P＜ 0.001；△ 與 D 組 比 較，qA=3.841，P＜0.001。脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率：#與C組比較，qA=15.829，P ＜ 0.001，qB=35.894，P ＜ 0.001，qD=16.330，P ＜ 0.001；*與 B組比較，qA=13.017，P＜0.001，qD =19.091，P＜0.001；△與D組比較，qA =3.479，P＜0.01

組別 脊髓神經(jīng)元活力 脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率（%）A組（n=25） 0.71±0.12#*△ 18.81±3.14#*△B組（n=25） 0.35±0.11#△ 29.85±2.85#△C 組（n=25） 1.57±0.32 8.52±0.84 D 組（n=25） 0.83±0.10#* 16.15±2.18#*F值 188.985 332.663 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達(dá)比較

四組在mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達(dá)上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組的mTOR磷酸化水平最低，與其他組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組的mTOR磷酸化水平最高，與其他組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組的TRESK mRNA表達(dá)最低，與其他組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組的TRESK mRNA表達(dá)最高，與其他組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達(dá)比較（）

表3 各組mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達(dá)比較（）

注：mTOR磷酸化水平：#與C組比較，qA=20.801，P＜0.001，qB=42.485，P ＜ 0.001，qD=24.962，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA=23.000，P＜ 0.001，qD=20.000，P＜ 0.001；△ 與 D 組 比 較，qA=3.536，P＜0.01。TRESK mRNA表達(dá)：#與C組比較，qA=6.753，P ＜ 0.001，qB=3.726，P ＜ 0.01，qD=42.464，P ＜ 0.001；*與 B 組比較：qA=2.386，P＜0.001，qD=20.209，P＜0.001；△與D組比較，qA=16.592，P＜ 0.001

組別 mTOR磷酸化水平 TRESK mRNA表達(dá)A組（n=25） 0.29±0.03#*△ 1.57±0.41#*△B組（n=25） 0.52±0.04#△ 1.30±0.39#△C 組（n=25） 0.14±0.02 1.00±0.10 D 組（n=25） 0.32±0.03#* 3.13±0.23#*F值 642.763 235.082 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛在臨床上較為常見，臨床療效不理想，其確切發(fā)病機(jī)制尚未明確[9-12]。多個(gè)研究顯示，脊髓神經(jīng)元凋亡在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)揮了作用，有研究顯示，谷氨酸是機(jī)體傳達(dá)傷害性的信息傳入時(shí)的較為重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，是目前臨床上公認(rèn)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生損傷和神經(jīng)元凋亡的重要元素[13-15]。也有研究顯示，不同的氨基酸受體可以以不同方式對(duì)其相應(yīng)的蛋白、酶類及其他神經(jīng)元素發(fā)生作用，對(duì)神經(jīng)病理性疼痛起到重要作用[16-17]。因此在本研究中采用谷氨酸對(duì)SD大鼠脊髓神經(jīng)元進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡后顯示經(jīng)過(guò)谷氨酸刺激的細(xì)胞活力下降且細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)升高。

本研究顯示，經(jīng)谷氨酸及TRESK siRNA處理后的SD大鼠cleaved Caspase3和Bax表達(dá)水平上升、脊髓神經(jīng)元活力降低且脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率最高，未經(jīng)處理的SD大鼠脊髓神經(jīng)元cleaved Caspase3和Bax表達(dá)水平低，呈現(xiàn)較高的神經(jīng)元活力且脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率也較低。原因?yàn)樵诓±項(xiàng)l件中，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的鉀離子水平降低，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，而鉀離子則是TRESK通道最重要的背景離子[18-20]。有研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛的SD大鼠脊髓神經(jīng)元中TRESK表達(dá)降低[21]。還有研究顯示，TRESK由谷氨酸激活，本研究也顯示隨著cleaved Caspase3和Bax表達(dá)水平上升，TRESK mRNA表達(dá)下降，脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡也出現(xiàn)增高。本研究結(jié)果顯示，谷氨酸可以對(duì)脊髓神經(jīng)元的凋亡通過(guò)多個(gè)同信號(hào)通路進(jìn)行介導(dǎo)，因此推測(cè)TRESK的水平上升可以使機(jī)體發(fā)生某種相關(guān)機(jī)制；另一方面也顯示了TRESK水平下調(diào)與脊髓神經(jīng)元凋亡的發(fā)生及發(fā)展有著相關(guān)性[22]。mTOR屬于PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）類家族，是各信號(hào)通路較為重要的蛋白。脊髓損傷可以激活mTOR信號(hào)mTOR通路并且使神經(jīng)元發(fā)生凋亡，且由mTOR通路主導(dǎo)的脊髓水平神經(jīng)元凋亡參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[23-24]。本研究結(jié)果顯示，在谷氨酸對(duì)脊髓神經(jīng)元凋亡過(guò)程產(chǎn)生作用的時(shí)候，mTOR出現(xiàn)質(zhì)變級(jí)活化，TRESK siRNA對(duì)神經(jīng)元的TRESK水平起到一定程度的降低作用，隨著mTOR的活化程度加深，神經(jīng)元的凋亡程度也加重，但在增加了mTOR特異性抑制劑之后就降低了TRESK siRNA對(duì)SD大鼠脊髓神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，在由TRESK介導(dǎo)的mTOR信號(hào)通路，抑制谷氨酸可以誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元凋亡，對(duì)神經(jīng)病理性疼痛臨床上的治療方案推進(jìn)等具有積極意義。