青稞多糖對糖尿病模型小鼠的降血糖作用及機制研究

王生亞 薛潔 徐乃玉 張真慶 呂棟

摘 要 目的：研究青稞多糖（HVP）對糖尿病模型小鼠的降血糖作用及機制。方法：對小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（120 mg/kg）以復(fù)制糖尿病模型。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（陽性對照，200 mg/kg）和HVP高、中、低劑量組（300、150、75 mg/kg），另設(shè)空白對照組，每組10只。各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組和模型組小鼠灌胃等量水，每天1次，連續(xù)30 天。給藥10、20、30 天時測定小鼠的空腹血糖（FBG）;末次FBG測定后，小鼠腹腔注射10%葡萄糖溶液（2 g/kg），于注射后30、120 min時測定糖耐受量（GTT）曲線下面積;測定小鼠血清中胰島素水平和肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）的含量;采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠胰腺組織病理學(xué)變化。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組小鼠FBG、GTT曲線下面積和肝組織中MDA含量均顯著升高或增加（P<0.01）;血清中胰島素水平和肝組織中SOD、GSH-Px含量均顯著降低 （P<0.01）;胰腺組織損傷嚴(yán)重，形態(tài)不完整，有明顯的空泡。與模型組比較，HVP高劑量組小鼠FBG、GTT曲線下面積和肝組織中MDA含量均顯著降低或減少（P<0.05或P<0.01），血清中胰島素含量和肝組織中SOD、GSH-Px含量均顯著升高 （P<0.05或P<0.01），HVP低、中劑量組上述指標(biāo)部分改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;胰腺組織損傷有所減輕，形態(tài)較為完整，胰島細胞排列緊密，空泡減少。結(jié)論：HVP可降低糖尿病模型小鼠的血糖水平，升高胰島素水平并減輕胰腺組織損傷;該作用機制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞 青稞多糖;糖尿病;抗氧化;小鼠

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）07-0807-05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the hypoglycemic effect of Hordeum vulgare polysaccharide （HVP） on diabetes mellitus model mice and its mechanism. METHODS： The mice were given intraperitoneal injection of streptozotocin （120 mg/kg） to induce diabetes mellitus model. After modeling， the mice were randomly divided into model group， metformin group （positive control， 200 mg/kg）， HVP high-dose， medium-dose and low-dose groups （300， 150 and 75 mg/kg）， with 10 mice in each group. Blank control group was established additionally. Administration groups were given relevant medicine intragastrically; blank control group and model group were given constant volume of water intragastrically， once a day， for consecutive 30 days. The levels of fasting blood glucose （FBG） were determined after 10， 20， 30 days of administration. After last FBG test， mice were intraperitoneally injected with 10% glucose solution （2 g/kg）， then the area under the glucose tolerance （GTT） curve was measured at 30 and 120 min after injection. The serum levels of insulin， the content of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， malondialdehyde （MDA） in liver tissue were detected. Pancreatic morphology of mice were detected by HE staining. RESULTS： Compared with blank control group， the FBG， area under GTT curve and MDA contnet in liver tissue were increased significantly in model group （P<0.01）， while serum levels of insulin， SOD and GSH-Px contents in liver tissue were decreased significantly （P<0.01）; the pancreatic tissue was seriously damaged with incomplete morphology and obvious vacuoles. Compared with model group， FBG， area under GTT curve， MDA content in liver tissue were decreased significantly in HVP high-dose group （P<0.05 or P<0.01）， serum content of insulin， the content of SOD and GSH-Px in liver tissue were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; above indexes of HVP low-dose and medium-dose groups were improved partially， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）; the pancreatic tissue damage was alleviated， the morphology was relatively complete， the islet cells were closely arranged， and the vacuoles were reduced. CONLUSIONS： HVP can reduce the level of blood glucose in diabetic model mice， increase insulin level and relieve pancreatic injury. The mechanism may be related to its antioxidation.

KEYWORDS? ?Hordeum vulgare polysaccharide; Diabetes mellitus; Antioixidation; Mice

糖尿病是由于體內(nèi)胰島素絕對缺乏或相對不足引起的慢性疾病，以血糖持續(xù)升高為特征，從而誘發(fā)各種器官、組織損害與功能障礙，嚴(yán)重威脅著人類健康[1-3]。2000年，全球成人糖尿病患者約1.51億，到2019年已達4.63億，預(yù)計2045年糖尿病患者總?cè)藬?shù)將超過6.29億[4]。糖尿病正在逐漸成為全球健康的經(jīng)濟負擔(dān)，同時糖尿病患者也逐漸呈現(xiàn)出一種年輕化的趨勢[5]。

目前治療糖尿病的藥物多具有一些副作用，如體質(zhì)量增加、低血糖、過敏反應(yīng)、乳酸酸中毒、水腫等[6]。因此，開發(fā)天然的、副作用小的藥物成為目前研究糖尿病治療藥物的重點。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖的降糖作用具有作用溫和、毒副作用小、來源廣泛等優(yōu)點，極具開發(fā)潛質(zhì)，如靈芝、紫蘇葉、紅豆杉、三七等多糖的降血糖作用均有報道[7-10]。

青稞是禾本科大麥屬作物，主要分布于海拔4 200～ 4 500米的高寒地區(qū)，具有高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖等特點，并富含微量元素、β-葡聚糖等營養(yǎng)成分，研究表明青稞具有調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力等功能[11-13]。體外研究顯示，青稞多糖（HVP）具有抑制α-淀粉酶活性、降低淀粉消化率的作用[14];體內(nèi)研究表明，HVP能降低由鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠的空腹血糖（FBG）和糖耐受量（GTT）[15]，但其體內(nèi)降血糖的作用機制尚不明確。有研究指出，機體在持續(xù)高血糖狀態(tài)下，活性氧簇（ROS）生成加速，可出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[16]。基于此，本研究采用腹腔注射STZ復(fù)制小鼠糖尿病模型，并考察灌胃給予HVP后其降血糖的作用及機制，為其進一步研究和開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：5810型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、EL-204型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、ELx-800型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）、HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）、CX21型生物顯微鏡（日本Olympus公司）、MR22i型低溫高速離心機（法國Jouan公司）、S7/15型超純水機（英國ELGA LabWater公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：STZ（美國Sigma公司，批號S0130），二甲雙胍片（浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號1602086，規(guī)格250 mg/片），葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號20171027），小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號EL-M1382），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20171019、20171020、20171129、20171020），耐高溫淀粉酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號a109182）;其余試劑為實驗室常用試劑或規(guī)格，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為清潔級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證為SCXK（滬）2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于每日光照12 h、溫度（21.5±1.5） ℃、相對濕度（47±5）%的動物房中。

2 方法

2.1 HVP制備

參考文獻[17]方法制備HVP。稱取青稞60 g，以80%乙醇溶液為提取劑，于75 ℃回流2 h，以4 500 r/min離心15 min，收集沉淀并將其置于50 ℃干燥箱中烘干。將烘干后的沉淀加入15倍量水（按mL/mg計），攪拌均勻后，以20%Na2CO3溶液調(diào)pH至10，并加入9.0 mL（約270 U）耐高溫淀粉酶，于95 ℃回流2 h后，再以1 mol/L HCl 溶液調(diào)pH至3.0～4.5以沉淀蛋白;以4 500 r/min離心15 min分離蛋白，取上清液以20% Na2CO3溶液調(diào)pH至7.0，然后濃縮至60 mL;加入35%硫酸銨溶液，析出HVP粗品，再加水復(fù)溶，以去除小分子雜質(zhì);經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后即得精制的HVP干燥樣品（得率為3.2%，純度≥99.6%）。

2.2 分組、造模與給藥

小鼠禁食12 h后，隨機取10只作為空白對照，其余80只小鼠每天腹腔注射STZ（120 mg/kg）1次，連續(xù)注射3 天后，根據(jù)其血清中FBG測定結(jié)果，剔除不符合模型要求（FBG值小于11.1 mmol/L或大于25 mmol/L）的小鼠[18]。將符合模型要求的小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（陽性對照，200 mg/kg，給藥劑量參考文獻[8]）和HVP低、中、高劑量組（75、150、300 mg/kg，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置），每組10只。模型組和空白對照組小鼠每天灌胃給予等量水，各給藥組小鼠每天灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30 天。

2.3 小鼠FBG的測定

各組小鼠在給藥前（0 天）和給藥后10、20、30天時，于早上8點開始禁食4 h，然后分別從眼眶靜脈叢取血。血樣于 4 ℃條件下靜置1 h后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清。按照試劑盒說明書方法操作，檢測小鼠血清中FBG水平。

2.4 小鼠GTT曲線下面積的測定

各組小鼠末次測定FBG后，腹腔注射10%葡萄糖溶液（2 g/kg），然后分別在腹腔注射后30 、120 min時按相應(yīng)試劑盒說明書方法測定小鼠的血糖，然后參考文獻[19]方法計算GTT曲線下面積。

2.5 小鼠血清中胰島素水平測定

小鼠GTT曲線下面積測定結(jié)束后，禁食不禁水8 h，然后于其眼眶取血。血樣在4 ℃條件下靜置1 h后，以? 3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明書相關(guān)方法操作，檢測小鼠血清中胰島素水平。

2.6 小鼠肝組織中GSH-Px、SOD、MDA含量測定

采血結(jié)束后，處死小鼠，分離肝臟，并用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗肝表面殘留血跡，濾紙吸干。稱取適量肝組織，加入預(yù)冷的生理鹽水，制備10%肝組織勻漿液，然后在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，檢測小鼠肝組織中GSH-Px、SOD、MDA的含量。

2.7 小鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取處死后各組小鼠的胰腺組織，以10%甲醛固定24 h后，以乙醇進行脫水，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后制作切片（4 μm）;切片經(jīng)脫蠟水洗后，進行蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)變化。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HVP對糖尿病模型小鼠FBG的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠給藥0、10、20、30 天時，F(xiàn)BG均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組和HVP高劑量組小鼠給藥10、20、30 天后，F(xiàn)BG均顯著降低（P<0.05或P<0.01），HVP低劑量組給藥10天以及高劑量組給藥10、30天后，F(xiàn)BG均顯著降低（P<0.01），詳見表1。

3.2 HVP對糖尿病模型小鼠GTT曲線下面積的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠在腹腔注射葡萄糖后30、120 min時的血糖水平均顯著升高（P<0.01），GTT曲線下面積均顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組和HVP中、高劑量組小鼠腹腔注射葡萄糖后30、120 min時的血糖水平均顯著降低（P<0.01），GTT曲線下面積均顯著減少（P<0.01），詳見表2。

3.3 HVP對糖尿病模型小鼠血清中胰島素水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中胰島素水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，HVP各劑量組小鼠血清中胰島素水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.4 HVP對糖尿病模型小鼠肝組織中GSH-Px、SOD、MDA含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中GSH-Px、SOD含量顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和HVP中、高劑量組小鼠肝組織中GSH-Px、SOD（二甲雙胍組除外）含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），HVP低劑量組MDA含量顯著降低（P<0.05），詳見表4。

3.5 HVP對糖尿病模型小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響

空白對照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整且形態(tài)規(guī)則，胰島細胞排列緊密且大小均勻，細胞質(zhì)豐富無空泡化;模型組小鼠胰腺組織損傷嚴(yán)重、形態(tài)不完整，有明顯空泡;二甲雙胍組和HVP各劑量組小鼠胰腺組織形態(tài)較為完整，胰島細胞排列緊密、損傷有所減輕，空泡減少，詳見圖1。

4 討論

本研究采用腹腔注射STZ以復(fù)制小鼠糖尿病模型，用于考察HVP的降血糖作用，結(jié)果顯示，糖尿病模型小鼠FBG和GTT曲線下面積顯著升高或增加、血清胰島素水平顯著降低，且胰腺組織損傷嚴(yán)重、形態(tài)不完整、有明顯空泡，說明本研究糖尿病模型復(fù)制成功。對糖尿病模型小鼠連續(xù)灌胃HVP 30 天后發(fā)現(xiàn)，小鼠FBG和GTT曲線下面積均不同程度地降低或減少，血清中胰島素水平均顯著升高，且胰腺組織損傷有所減輕、空泡減少、形態(tài)較為完整，表明HVP可降低糖尿病模型小鼠的血糖水平，并減輕胰腺組織損傷。

氧化應(yīng)激是一種氧化與抗氧化平衡的紊亂所引起的活細胞功能失調(diào)狀態(tài)[20]。SOD、GSH-Px、MDA是反映機體氧化應(yīng)激水平的主要指標(biāo)，其中SOD、GSH-Px為體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，MDA含量的高低可直接反映機體氧化應(yīng)激水平的嚴(yán)重程度[21]。氧化應(yīng)激在糖尿病早期和并發(fā)癥進展中具有重要作用，與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[22]。在降低糖脂水平的前提下進行抗氧化治療，能夠更加有效地提高胰島素的敏感性，改善葡萄糖耐受水平[23]。植物多糖通過降低氧化應(yīng)激水平發(fā)揮降血糖作用已有研究證實，如鐵皮石斛多糖能顯著提高2型糖尿病小鼠的總抗氧化能力，修復(fù)其肝和胰腺組織的氧化損傷，從而提高胰島素水平和緩解胰島素抵抗，具有良好的降血糖作用[24];紅豆杉多糖可升高糖尿病模型大鼠脾、胸腺組織中SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，從而發(fā)揮降血糖作用[9];雞腿菇多糖對STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠也具有較好的抗氧化活性，可升高大鼠體內(nèi)的SOD含量、降低MDA含量，從而起到降血糖的作用[25]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HVP可降低肝組織中MDA含量和升高SOD、GSH-Px含量，提示HVP可能通過抗氧化作用，改善糖尿病模型小鼠的氧化應(yīng)激水平，進而發(fā)揮其抗糖尿病作用。

綜上所述，HVP可降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠的血糖水平，提高其胰島素水平并改善胰腺組織損傷;該作用機制可能其抗氧化作用有關(guān)。

參考文獻

[ 1 ] JIA G，AROOR A R，MARTINEZ-LEMUS L A. Invited review：over-nutrition，mTOR signaling and cardiovascular diseases[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2014，307（11）：F1198-F1206.

[ 2 ] XU Y J，TAPPI P S，NEKI N S，et al. Prevention of diabetes-induced cardiovascular complications upon treatment with antioxidants[J]. Heart Fail Rev，2014，19（1）：113-121.

[ 3 ] 諸夔妞，肖洪賀，壽旗，等.絞股藍及其活性成分改善糖尿病并發(fā)癥作用機制的研究進展[J].中國藥房，2020，31（8）：1015-1020.

[ 4 ] SAEEDI P，PETERSOHN I，SALPEA P，et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045：results from the international diabetes federation diabetes atlas，9th edition[J]. Diabetes Res Clin Pract，2019，157：107843.

[ 5 ] Centers for Disease Control and Prevention. National diabetes statistics report：estimates of diabetes and its burden in the United States[EB/OL].[2020-11-11].http：//www.cdc.gov/diabetes/pubs/statsreport14/national-diabetes-report-web.

[ 6 ] CHAO E C，HENRY R R. SGLT2 inhibition：a novel stra- tegy for diabetes treatment[J]. Nat Rev Drug Discov，2010，9（7）：551-559.

[ 7 ] XIAO C，WU Q P，XIE Y Z，et al. Hypoglycemic mechanisms of Ganoderma lucidum polysaccharides F31 in db/db mice via RNA-seq and iTRAQ[J]. Food Funct，2018，9（12）：6495-6507.

[ 8 ] 孫廣平，袁麗，方曉琳，等.楊海波紫蘇葉多糖對糖尿病模型小鼠胰腺組織氧化應(yīng)激及PI3K/AKT/GLUT4信號通路的影響[J].中國藥房，2020，31（15）：1874-1879.

[ 9 ] 史巖，王宇峰，郭麗嬌，等.紅豆杉多糖對糖尿病大鼠的降血糖作用及機制研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2020，43（1）：184-187.

[10] 楊潔，馬英慧，崔秀成，等.三七多糖對糖尿病模型大鼠的降血糖作用和眼視網(wǎng)膜病變的治療作用及其機制[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2017，43（4）：734-738.

[11] 汪海波，劉大川，汪海嬰，等.燕麥β-葡聚糖對糖尿病大鼠的血糖及糖代謝功能的影響研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：387-391.

[12] KUSMIATI，DHEWANTARA F X R. Cholesterol-lowering effect of beta glucan extracted from Saccharomyces cerevisiae in rats[J]. Sci Pharm，2016，84（1）：153-165.

[13] 王波，張文會，李梁，等.超聲波輔助青稞麥芽多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J].應(yīng)用化工，2018，47（6）：1137- 1139.

[14] 鄧婧，馬小涵，趙天天，等.青稞β-葡聚糖對淀粉體外消化性的影響[J].食品科學(xué)，2019，39（10）：106-110.

[15] 胡輝，劉鵬，程佩佩，等.小分子青稞β-葡聚糖輔助降血糖功能研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（21）：33-37.

[16] GHOSH S，CHOWDHURY S，SARKAR P，et al. Ameliorative role of ferulic acid against diabetes associated oxidative stress induced spleen damage[J]. Food Chem Toxicol，2018，118：272-286.

[17] RONG Y X，XU N Y，XIE B Y，at el. Sequencing analysis of β-glucan from highland barley with high performance anion exchange chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Food Hydrocoll，2017，73：235-242.

[18] EBRAHIMIAN T G，TAMARAT R，CLERGUE M，et al. Dual effect of angiotensin-converting enzyme inhibition on angiogenesis in type 1 diabetic mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25（1）：65-70.

[19] 許光遠，張曉明.降糖增效方對糖尿病大鼠肝臟胰島素信號通路IRS1位點磷酸化的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（2）：139-143.

[20] 趙國莉，呂國鋒，程千鵬.氧化應(yīng)激與2型糖尿病相關(guān)性的觀察[J].中國糖尿病雜志，2013，21（6）：514-517.

[21] MONICZEWSKI A，GAWLIK M，SMAGA I，et al. Oxidative stress as an etiological factor and a potential treatment target of psychiatric disorders：part 1：chemical aspects and biological sources of oxidative stress in the brain[J]. Pharmacol Rep，2015，67（3）：560-568.

[22] EDRIS A，OZAR T，MOHSENI S，et al. Effect of probio- tics supplementation on glucose and oxidative stress in type 2 diabetes mellitus：a meta-analysis of randomized trials[J]. DARU J Pharm Sci，2019，27（2）：827-837.

[23] OGUNTIBEJU O O. Type 2 diabetes mellitus，oxidative stress and inflammation：examining the links[J]. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2019，11（3）：45-63.

[24] 王云威，王景雪.鐵皮石斛多糖對2型糖尿病小鼠降糖降脂的作用[J].食品科學(xué)，2020，41（21）：127-132.

[25] 段懿涵，徐健，盧學(xué)春，等.雞腿菇多糖對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠的降血糖作用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2019，29（12）：76-81.

（收稿日期：2020-12-11 修回日期：2021-01-26）

（編輯：唐曉蓮）