等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食源性致病菌檢測中的研究進(jìn)展

董晶，盧鑫，郭威，楊倩，張偉,,3*

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定，071001)2(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理工學(xué)院，河北 滄州，061100) 3(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定，071001)

食源性致病菌的檢測是預(yù)防與控制食源性疾病的關(guān)鍵步驟之一。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法公認(rèn)度高，穩(wěn)定性好，但檢測周期較長，耗時(shí)費(fèi)力[1]。因此加強(qiáng)對(duì)食源性病原菌的快速檢測與篩查對(duì)保障食品安全至關(guān)重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸檢測技術(shù)成為近年來研究熱點(diǎn)之一，最早開發(fā)的PCR技術(shù)及其拓展技術(shù)在食源性致病菌的檢測與鑒定中發(fā)揮著重要的作用，但該技術(shù)需經(jīng)歷反復(fù)的升降溫過程，對(duì)設(shè)備要求高。隨后等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)逐漸發(fā)展起來，在恒定溫度下即可反應(yīng)，擺脫了對(duì)精密溫度循環(huán)設(shè)備的依賴。

目前常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(single primer isothermal amplification，SPIA)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)以及河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物檢測技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)自主開發(fā)的跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增(saltatory rolling circle amplification，SRCA)等。

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)依據(jù)檢測目標(biāo)不同可分為“目標(biāo)放大”和“信號(hào)放大”兩類，LAMP、SDA、SPIA以及SRCA均屬于目標(biāo)放大擴(kuò)增技術(shù)；RCA則歸類于信號(hào)放大技術(shù)。以擴(kuò)增對(duì)象的不同可分為“DNA擴(kuò)增”和“RNA擴(kuò)增”兩大類，上述5種等溫?cái)U(kuò)增方法均屬于DNA擴(kuò)增。本文綜合國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，對(duì)上述5種技術(shù)的研究進(jìn)展以及存在的共性問題進(jìn)行簡要概述，并提出改進(jìn)措施，為食源性致病菌的快速檢測與篩查以及食源性疾病的預(yù)防與控制提供了參考依據(jù)。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

LAMP最早由日本學(xué)者NOTOMI等[2]開發(fā)。該方法依靠具有強(qiáng)鏈置換活性的BstDNA聚合酶和4～6條特異性引物在60～65 ℃恒定溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)設(shè)備要求低，基于LAMP技術(shù)的一些拓展技術(shù)已成功應(yīng)用于食源性致病菌的檢測[3]。相興偉等[4]利用雙重LAMP法同時(shí)檢測海產(chǎn)品中的霍亂弧菌和副溶血性弧菌，檢出限均為50 CFU/mL；還可通過觀察產(chǎn)物濁度判定結(jié)果，提高檢測效率。CHUN等[5]將LAMP方法和回射Janus粒子(retroreflective Janus particle,RJP)相結(jié)合開發(fā)了一種基于LAMP技術(shù)的傳感器方法用于檢測沙門氏菌，通過RJP的數(shù)目定量分析LAMP產(chǎn)物的濃度，檢測限達(dá)到了102CFU/mL。

LAMP方法具有極高的特異性，不易受非靶基因的影響，若向體系中加入環(huán)引物，反應(yīng)時(shí)間可縮短一半[6]。但用凝膠電泳法觀察擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)較為模糊，且易受氣溶膠污染[7-8]。LAMP反應(yīng)引物數(shù)量多，引物間易相互作用，影響擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性，且LAMP產(chǎn)物結(jié)果分析僅能判斷是否擴(kuò)增，無法對(duì)產(chǎn)物的來源以及產(chǎn)物的特異性進(jìn)行分析。

2 鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

SDA技術(shù)于1992年由WALKER等[9]開發(fā)。該技術(shù)的核心是利用限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割DNA鏈上的特定位點(diǎn)，打開缺口，被切割下來DNA鏈的3′端在聚合酶的作用下不斷延伸，并將下游序列置換下來，在等溫條件下成幾何倍數(shù)級(jí)聯(lián)擴(kuò)增。有研究表明SDA-DNA傳感器技術(shù)與qPCR方法及常規(guī)方法相比更加快速、準(zhǔn)確[10]。WU等[11]將SDA與免疫層析結(jié)合用于檢測食品中的大腸桿菌O157：H7，檢測限為10 CFU/mL，僅捕獲在細(xì)胞膜上的適體，降低假陽性結(jié)果發(fā)生的概率，且無需進(jìn)行DNA提取，操作更加簡便、快捷。鄧世瓊等[12]利用缺口酶Nt.BstNBI替代限制性內(nèi)切酶用于SDA反應(yīng)，不僅解決了傳統(tǒng)鏈置換技術(shù)中要使用修飾底物的問題，還大大降低了成本，對(duì)于質(zhì)粒檢測的靈敏度低至2 pmol/L。

隨著對(duì)SDA技術(shù)研究的不斷深入，該技術(shù)也暴露出一些不足之處，SDA反應(yīng)體系中的dNTP大多需進(jìn)行加工修飾，且靶序列的長度一般不超過200 bp；此外，SDA的擴(kuò)增產(chǎn)物序列兩端含有內(nèi)切酶的識(shí)別序列或其殘端，無法進(jìn)行克?。划a(chǎn)物不均一易出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象等。

3 單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

SPIA技術(shù)是近些年報(bào)道的一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[13]，產(chǎn)物為單鏈DNA，已成功應(yīng)用于食源性致病菌的檢測[14]。YANG等[15]利用SPIA技術(shù)快速檢測蘋果汁中的酸曲霉，檢出限低至4.8 CFU/mL。GUO等[16]將SPIA與快速等溫檢測分析相結(jié)合用于檢測B組鏈球菌DNA，檢出限低至102copies/mL?？稍诓婚_蓋的情況下在紫外輻射下直觀判定結(jié)果，由于產(chǎn)物不能用作擴(kuò)增目標(biāo)，因此在一定程度上可避免氣溶膠污染，操作簡單、快速、靈敏，適用于基層企業(yè)機(jī)構(gòu)。

SPIA技術(shù)引物數(shù)量少、擴(kuò)增效率高，SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物因缺少大部分5′端引物區(qū)序列使產(chǎn)物DNA無法與引物發(fā)生結(jié)合，可減少擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。但雜合引物的設(shè)計(jì)與合成相對(duì)復(fù)雜，且不能對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，需對(duì)起始模板量定量時(shí)，只能通過其他方法如熒光定量PCR進(jìn)行分析。

4 滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

RCA是于1995年被開發(fā)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[17-19]，可分為線性擴(kuò)增和指數(shù)擴(kuò)增兩類[20]，其目的序列的檢測也有兩種方式，當(dāng)模板為環(huán)狀單鏈DNA時(shí)，直接檢測擴(kuò)增信號(hào)即可[21]；當(dāng)模板為線性單鏈DNA時(shí)，則需利用鎖式探針和連接酶對(duì)模板進(jìn)行人為環(huán)化，繼而檢測擴(kuò)增信號(hào)。有研究表明適配體探針可增強(qiáng)RCA的擴(kuò)增信號(hào)[22]。TENG等[23]利用適配體/免疫組合的電化學(xué)生物傳感器模型檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，檢測限低至2 CFU/mL，且在不同生產(chǎn)批次的電極上重復(fù)性良好。GE等[24]將金納米顆粒沉積在電極上，同時(shí)結(jié)合RCA技術(shù)將靶物質(zhì)和適體結(jié)合的信號(hào)特異性放大，實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的超靈敏檢測，檢出限低至16 CFU/mL，重復(fù)性好，且不易受基質(zhì)的影響。

RCA反應(yīng)具有特異性強(qiáng)[25]、可檢測到特定信號(hào)以及高通量檢測的特點(diǎn)，但RCA反應(yīng)易受到復(fù)雜基質(zhì)條件的影響。再者，RCA擴(kuò)增效率易受鎖式探針雜交以及探針與模板連接效率的影響。RCA反應(yīng)在擴(kuò)增時(shí)背景信號(hào)干擾問題嚴(yán)重，檢測效率低[26]。無論是指數(shù)擴(kuò)增還是線性擴(kuò)增，都要求模板為環(huán)狀，過程繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力[27]。

5 跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

SRCA是由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物檢測技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一種新型體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[28-29]。對(duì)于線性DNA的擴(kuò)增，在BstDNA聚合酶作用下，添加若干個(gè)堿基合成單鏈DNA，從而跨過模板鏈兩端的“缺口”，形成非閉合環(huán)。繼而將先前合成的互補(bǔ)鏈置換下來，被置換下來的單鏈就像“卷尺”一樣不斷被拉長。同時(shí)，暴露出引物結(jié)合位點(diǎn)，引物與之結(jié)合并延伸，擴(kuò)增產(chǎn)物為以靶序列和添加序列為單元的多個(gè)重復(fù)序列。SRCA技術(shù)目前已成功應(yīng)用于食源性致病菌的檢測中。YANG等[30]利用該技術(shù)檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，靈敏度為7.8 fg/μL。張?zhí)N哲等[31]將SYBR Green I熒光染料與SRCA技術(shù)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的可視化鑒定。

該技術(shù)與RCA技術(shù)相比，無需鎖式探針和連接酶以及人為環(huán)化過程，操作步驟簡單，成本降低約3/4；與LAMP技術(shù)相比，所需引物數(shù)量減少，避免了引物之間的相互作用，成本降低約1/2，可通過測序驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果的正確性。但SRCA技術(shù)也存在一定的不足，該技術(shù)需進(jìn)行大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出1對(duì)特異性強(qiáng)的引物。此外，該技術(shù)在以往的研究中都是定性檢測，且主要是對(duì)單一目標(biāo)菌株的研究。該技術(shù)目前應(yīng)用范圍主要集中在食源性致病菌的檢測，針對(duì)摻假、轉(zhuǎn)基因、過敏原的檢測與鑒定尚在開發(fā)中。

6 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較

本研究將上述5種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，詳情見表1，相比于最先發(fā)展起來的PCR技術(shù)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擺脫了對(duì)昂貴且精密的溫度循環(huán)設(shè)備的依賴，更加適用于基層企業(yè)。對(duì)于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，引物的特異性與數(shù)量都與擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性緊密相關(guān)。對(duì)于引物數(shù)量而言，SPIA技術(shù)僅需1條引物，最大可能的降低了引物自身的干擾問題；而LAMP反應(yīng)引物數(shù)量多，易發(fā)生非特異擴(kuò)增。對(duì)于反應(yīng)溫度而言，SDA技術(shù)與RCA技術(shù)所需溫度不高，相比于其他技術(shù)更容易發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，但也因此在試驗(yàn)操作過程中，需嚴(yán)格控制環(huán)境溫度。對(duì)于反應(yīng)時(shí)間而言，SRCA技術(shù)反應(yīng)更加快速。對(duì)產(chǎn)物類型而言，LAMP技術(shù)、RCA(指數(shù)擴(kuò)增)技術(shù)以及SRCA技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物均為雙鏈DNA，最為穩(wěn)定，易于檢測，但也易造成交叉污染；SPIA技術(shù)、SDA技術(shù)及RCA(線性擴(kuò)增)技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物則為單鏈DNA。

表1 五種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的對(duì)比Table 1 Comparison of five isothermal amplification techniques

7 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的共性問題及解決措施

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的共性問題主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)無法區(qū)分死活菌。等溫?cái)U(kuò)增的靶標(biāo)為核酸，而無法判斷核酸的來源。(2)檢測病原菌種類有限。目前應(yīng)用最多的是對(duì)1種或2種病原菌核酸的檢測，若要同時(shí)檢測多種病原菌則需加入多對(duì)引物，引物自身易相互反應(yīng)而影響擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。(3)前處理耗時(shí)費(fèi)力。雜質(zhì)的存在會(huì)造成堿基間氫鍵的損傷，影響引物與靶基因的結(jié)合，因此需經(jīng)富集、提純等操作來降低蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，步驟繁瑣，耗時(shí)長，還會(huì)導(dǎo)致信噪比降低。(4)易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增靶標(biāo)的同時(shí)對(duì)于非靶標(biāo)序列也進(jìn)行了快速擴(kuò)增。

隨著對(duì)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)研究的不斷深入與改進(jìn)，針對(duì)以上問題也有了一些改進(jìn)方法。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)可選擇性的穿過死細(xì)胞的細(xì)胞膜與dsDNA發(fā)生不可逆的交聯(lián)反應(yīng)，抑制后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，因此可區(qū)分死活菌[32-34]。LYU等[35]首次將PMAxx染料與qLAMP結(jié)合，用于食源性VBNC狀態(tài)病原體的檢測，為大量食品現(xiàn)場快速檢測提供了一種新方法。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)核酸高通量快速檢測，操作簡單快速，成本低。李偉昊等[36]使用FTA濾膜直接對(duì)樣品進(jìn)行處理，并制備模板DNA，無需進(jìn)行繁瑣的前處理操作，縮短時(shí)間約12 h。針對(duì)氣溶膠污染問題，可在反應(yīng)體系中加入羥基奈酚藍(lán)實(shí)現(xiàn)閉管檢測；一次性檢測裝置的開發(fā)與使用也大大降低了氣溶膠污染的影響；此外，還可向反應(yīng)體系中加入液體石蠟以減少交叉污染[37]。針對(duì)假陽性問題，ZHANG等[38]開發(fā)了一種CRISPR/Cas12a系統(tǒng)可消除假陽性結(jié)果，此外，該研究中使用的尿嘧啶DNA糖基酶也可有效防止DNA擴(kuò)增子的污染[39]，此方法較為新穎，在分子檢測中具有巨大的應(yīng)用潛力。TIAN等[40]巧妙地將RCA和LAMP相結(jié)合，RCA產(chǎn)物可直接用于LAMP反應(yīng)，僅需一種聚合酶，無需任何樣品轉(zhuǎn)移步驟，即可在一個(gè)步驟中同時(shí)進(jìn)行RCA反應(yīng)和LAMP反應(yīng)，靈敏度得到顯著提高。針對(duì)產(chǎn)物分析中拖帶現(xiàn)象，可通過優(yōu)化體系中各離子的濃度減少此現(xiàn)象的發(fā)生[41]。

8 小結(jié)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究范圍不僅僅局限于病原菌的檢測，還可應(yīng)用于其他領(lǐng)域。LAMP技術(shù)還可應(yīng)用于臨床病原微生物、DNA病毒、RNA病毒、真菌、胚胎性別鑒定以及轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域中；RCA技術(shù)還可應(yīng)用于細(xì)胞原位檢測、單核苷酸多肽分析以及測序等方面；SPIA技術(shù)還可應(yīng)用于基因表達(dá)分析、基因突變分析以及核酸測序等方面；SDA技術(shù)還可應(yīng)用于丙型肝炎病毒及臨床疾病診治等領(lǐng)域中；SRCA技術(shù)還可應(yīng)用于食品中轉(zhuǎn)基因、過敏原及摻偽成分的檢測等。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和PCR技術(shù)的不足。新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也在不斷崛起，我國自主研發(fā)的重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也逐漸發(fā)展起來，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物檢測技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)自主開發(fā)的SRCA技術(shù)目前也正處于多領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用中。相信在今后的研究發(fā)展中，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測機(jī)制會(huì)變得更加智能化、節(jié)約化、便攜化。