食品中含硫氨基酸含量測(cè)定前處理?xiàng)l件的研究

葉穎慧，別致，唐凌軒，田燕

1(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123)2(中檢科(北京)測(cè)試技術(shù)有限公司，北京，100123) 3(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心，北京，100123)

胱氨酸和蛋氨酸為食品中常見的含硫氨基酸。蛋氨酸又稱甲硫氨酸，化學(xué)名為2-氨基-4-甲巰基丁酸，蛋氨酸參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，同時(shí)也參與腎上腺素、膽堿、肉堿等的合成。胱氨酸又稱雙硫丙氨酸，化學(xué)名為3,3′-二硫代二丙氨基酸，可形成谷胱甘肽、高半胱氨酸和牛磺酸3種主要產(chǎn)物，進(jìn)而對(duì)人體免疫功能產(chǎn)生影響[1-4]。食物中含硫氨基酸的含量是蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，也是嬰幼兒配方食品氨基酸模式的重要評(píng)價(jià)因素[5-7]。此外，有研究表明在美拉德反應(yīng)中含硫氨基酸對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮了重要作用。在油炸條件下含硫氨基酸還具有與叔丁基對(duì)苯二酚相當(dāng)?shù)目寡趸芰Γ虼丝梢宰鳛榭寡趸瘎┨砑佑谑称分?，以延長食品的貨架期[8-9]。因此，有必要測(cè)定食品中含硫氨基酸的含量，對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行探討。

食品中含硫氨基酸含量測(cè)定的研究分為游離含硫氨基酸含量和總含硫氨基酸(即游離的和蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸之和)含量的測(cè)定研究。對(duì)游離含硫氨基酸含量測(cè)定的研究通常是在食品中多種游離氨基酸含量測(cè)定的一小部分，研究方向偏重于液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等儀器方法的開發(fā)?？偤虬被岷繖z測(cè)的樣品前處理方式有直接酸水解法、保護(hù)試劑法和氧化水解法[10-11]。直接水解法會(huì)破壞—SH鍵，結(jié)果往往偏低。保護(hù)試劑法雖然可以一定程度上提高含硫氨基酸的測(cè)定結(jié)果，但與樣品中的實(shí)際含量仍存在較大差異。氧化水解法可以將含硫氨基酸中的蛋氨酸氧化為蛋氨酸砜，胱氨酸氧化水解為半胱磺酸。這2種物質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，因此，氧化水解法的測(cè)定結(jié)果更加接近真實(shí)值。氧化水解法最重要的是樣品的氧化效率。此外，由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，也可能在氧化過程中產(chǎn)生不同的氧化效果。采用氧化法測(cè)定含硫氨基酸含量的研究樣品基質(zhì)多以飼料、發(fā)酵液、乳粉和醫(yī)藥等為主，以及環(huán)境檢測(cè)中污泥中含硫氨基酸的測(cè)定等。研究的重點(diǎn)多放在色譜條件的改善和不同前處理方法對(duì)比(如酸水解與氧化水解)等方面。對(duì)于氧化水解法中影響氧化過程的因素沒有細(xì)致的研究，同時(shí)也未見全面研究食品中含硫氨基酸含量檢測(cè)的報(bào)道[12-24]。鑒于以上情況，本文選取谷物、豆類、肉類、乳制品、蛋類中5種典型食品樣品，探討氧化水解過程中氧化劑配制比例、氧化溫度、氧化時(shí)間對(duì)不同食品基質(zhì)中含硫氨基酸含量測(cè)定結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

S-433D氨基酸分析儀，德國賽卡姆公司；NDO-400恒溫電熱箱，上海愛朗儀器有限公司；Vortex-Genie 2渦旋混合儀，美國Scientific Industries公司；N-EVAPTM 112 氮吹儀，美國Organomation Associaes, Jnc 公司；ME204E電子天平，瑞士梅特勒-托利多國際有限公司；0.45 μm 津騰針式過濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

L-磺基丙氨酸一水合物(純度99%)，百靈威公司；DL-蛋氨酸砜(純度≥99.0%)，美國Sigma公司。

甲酸(分析純)，Sigma公司；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；雙氧水(含30%過氧化氫)，北京化工廠；氫溴酸(33%乙酸溶液)，百靈威公司；氮?dú)?純度≥99.9%)，北京北氧振興氣體工程技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

磺基丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(211 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取23.4 mg磺基丙氨酸于50 mL燒杯中，加入5 mL 6 mol/L的鹽酸溶液溶解，用水轉(zhuǎn)移稀釋定容至100 mL，混勻。

蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(200 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取24.3 mg蛋氨酸砜于50 mL燒杯中，加入5 mL 6 mol/L鹽酸溶液溶解，用水轉(zhuǎn)移稀釋定容至100 mL，混勻。

含硫氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取1 mL蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和1 mL磺基丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋定容至25 mL，混勻。

過甲酸溶液：取雙氧水和甲酸不同體積比混勻，放置1 h后使用?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

鹽酸溶液(6 mol/L)：取500 mL 鹽酸加水稀釋至1 000 mL，混勻。

不同pH和離子強(qiáng)度的洗脫用緩沖溶液：鈉系統(tǒng)緩沖溶液。

茚三酮溶液：鈉系統(tǒng)緩沖溶液。

1.2.2 前處理方法

(1)采樣和試樣制備

乳粉、全蛋粉、玉米粉：取有代表性的樣品, 用四分法縮減至200 g, 混勻, 裝入自封袋中, 避光, 備用。

黃豆：取有代表性的樣品, 用四分法縮減至200 g, 粉碎后過0.4 mm孔徑的分析篩, 混勻, 裝入自封袋中, 避光, 備用。

魚肉：取新鮮鯉魚肉，去骨去皮后進(jìn)行粉碎，混勻后裝入自封袋中，冷凍備用。

(2)樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量試樣(精確至0.000 1 g)于水解管內(nèi)，加入2 mL不同比例的過甲酸溶液，在不同溫度下，氧化不同時(shí)間。反應(yīng)完成后加入400 μL氫溴酸，放置30 min，在50～60 ℃下將水解管內(nèi)的溶液用氮?dú)獯蹈?。加?0 mL 6 mol/L鹽酸溶液，封口，放入(110 ±1) ℃的恒溫電熱箱內(nèi)，水解22 h后，取出冷卻至室溫。打開水解管，將水解液全部過濾轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶內(nèi)，用水定容至刻度，混勻。準(zhǔn)確吸取1 mL濾液在40～50 ℃下氮?dú)獯蹈?，干燥后殘留物? mL蒸餾水溶解，混勻，過0.45 μm濾膜，得到儀器待測(cè)液。

本文對(duì)前處理因素的考察為過甲酸配制比例、氧化時(shí)間、氧化溫度的影響。首先分別采用雙氧水與甲酸體積比為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13的氧化劑在0 ℃氧化樣品16 h，考察過甲酸配制比例對(duì)不同食品基質(zhì)中含硫氨基酸含量測(cè)定結(jié)果的影響。確定過甲酸配制比例后，考察氧化時(shí)間、氧化溫度2個(gè)影響因素?？疾斓难趸瘻囟葹?0、50和0 ℃。當(dāng)氧化溫度為70℃時(shí)，考察的氧化時(shí)間分別為1.0、2.5、5.0、7.5和10 min；當(dāng)氧化溫度為50 ℃時(shí)，考察的氧化時(shí)間分別為5.0、10、15、20和25 min；當(dāng)氧化溫度為0 ℃ 時(shí)，考察的氧化時(shí)間分別為8、12、16、20和24 h。

1.2.3 儀器測(cè)定

色譜條件：色譜柱：鈉系統(tǒng)分析柱(4.6 mm×150 mm)；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長：570 nm；梯度程序：見表1。流動(dòng)相A為pH 3.45檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖溶液(鈉離子濃度為0.12 mol/L)；流動(dòng)相B為蒸餾水；流動(dòng)相C為pH 10.85檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖溶液(鈉離子濃度為0.20 mol/L)；流動(dòng)相D為2%氫氧化鈉溶液。

表1 氨基酸分析儀流動(dòng)相的洗脫梯度Table 1 Elution gradient of mobile phase of amino acid analyzer

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化劑配制比例對(duì)含硫氨基酸檢測(cè)結(jié)果的影響

本文使用的氧化劑是過甲酸，由雙氧水與甲酸反應(yīng)生成。過甲酸在酸性介質(zhì)中產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而氧化樣品中的胱氨酸和蛋氨酸。過甲酸配制過程中雙氧水與甲酸的體積比會(huì)影響過甲酸中活性氧的濃度。本文采用6種不同體積比的雙氧水與甲酸，配制成不同濃度的過甲酸。在0 ℃氧化樣品16 h后，完成后續(xù)測(cè)定，得到5種食品中含硫氨基酸的含量。設(shè)雙氧水與甲酸體積比為1∶9時(shí)，樣品中胱氨酸和蛋氨酸的氧化率分別為100%，過甲酸的不同配制比例對(duì)食品中胱氨酸氧化率的影響見圖1，對(duì)蛋氨酸氧化率的影響見圖2。

圖1 過甲酸的不同配制比例對(duì)食品中胱氨酸氧化率的影響Fig.1 The influence of different proportion of performic acid on the oxidation rate of cystine in food

圖2 過甲酸的不同配制比例對(duì)食品中蛋氨酸氧化率的影響Fig.2 The influence of different proportion of performic acid on the oxidation rate of methionine in food

由圖1可以看出，使用6種不同配比的氧化劑對(duì)樣品進(jìn)行氧化，黃豆、嬰幼兒配方乳粉、魚肉和玉米粉中胱氨酸的氧化率都處于95%～105%。仔細(xì)觀察可以發(fā)現(xiàn)，隨著過甲酸中雙氧水含量的減少，這4種食品中胱氨酸的氧化率呈現(xiàn)先升高后降低或趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象，但影響比較小。這說明，當(dāng)雙氧水與甲酸的體積比為1∶3～1∶13時(shí)，雙氧水與甲酸的比例對(duì)這4種食品中胱氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響有限。對(duì)于全蛋粉，當(dāng)雙氧水與甲酸體積比為1∶3時(shí)，胱氨酸的氧化率低于95%，其誤差低限低于90%，隨著過甲酸中雙氧水含量的降低，胱氨酸氧化率逐漸升高，當(dāng)雙氧水與甲酸體積比為1∶7時(shí)，胱氨酸氧化率達(dá)到95%以上，在雙氧水與甲酸體積比為1∶9時(shí)達(dá)到最高值后，則有輕微的下降，但也可以保持在95%以上。通過圖2 可以看到，過甲酸的配制比例對(duì)黃豆中蛋氨酸氧化率的影響比較大。當(dāng)雙氧水與甲酸體積比為1∶3和1∶5時(shí)，其蛋氨酸的氧化率不足90%。對(duì)于全蛋粉和玉米粉而言，過甲酸的配制比例對(duì)蛋氨酸氧化率影響不大。此外，通過趨勢(shì)線可以看到，隨著過甲酸中雙氧水占比的降低，嬰幼兒配方奶粉、魚肉、黃豆中蛋氨酸氧化率也出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)。

以上的情況可以看到，配制過甲酸時(shí)，并不是雙氧水濃度越高，氧化效率越高。雙氧水與甲酸在特定比例下，才能得到較理想的氧化效果。有研究表明，在過甲酸的配制過程中，雖然雙氧水濃度的增加可以提高溶液中活性氧的含量，但也加速了過甲酸的分解反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲酸溶液中雙氧水的量偏高將導(dǎo)致在加入終止劑后反應(yīng)過于激烈，大量的溴溢出，出現(xiàn)部分迸濺現(xiàn)象，易發(fā)生危險(xiǎn)[26]。此外，對(duì)于這5種不同類型的食品，過甲酸配制比例對(duì)于胱氨酸和蛋氨酸檢測(cè)結(jié)果的影響出現(xiàn)了不同的反應(yīng)，這極有可能是樣品基質(zhì)差異造成的。通過氧化劑的不同配制比例的影響因素分析可知，過甲酸中雙氧水的占比并非越高越好，需要控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)才能得到更好的結(jié)果。在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用過程中，同一批次可能會(huì)涉及多種類型的樣品。因此，本文選擇1∶9的體積比配制過甲酸溶液，確保多數(shù)樣品得到充分的氧化，量值偏低的樣品結(jié)果也能夠控制在合理的誤差范圍內(nèi)。

2.2 不同氧化時(shí)間檢測(cè)結(jié)果的影響

含硫氨基酸氧化的程度受到反應(yīng)時(shí)間的影響，不同的樣品基質(zhì)在不同的氧化溫度和時(shí)間條件下可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。本文探討了70 ℃、50 ℃、0 ℃溫度下不同氧化時(shí)間對(duì)胱氨酸和蛋氨酸結(jié)果的影響，見表2～表4。

由表2和表3可以看出，在70 ℃和50 ℃下短時(shí)間氧化下，各樣品中含硫氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，沒有明顯的差異。通過數(shù)據(jù)間細(xì)微差異分析發(fā)現(xiàn)，無論50 ℃還是70 ℃，氧化時(shí)間為5 min時(shí)該溫度下樣品中含硫氨基酸含量的檢測(cè)結(jié)果均接近最大值。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在這2個(gè)較高溫度下，當(dāng)氧化時(shí)間超過5 min以后，魚肉的胱氨酸含量略有下降。

表2 70 ℃下不同水解時(shí)間對(duì)食品中含硫氨基酸含量測(cè)定結(jié)果的影響 單位：g/100g

表3 50 ℃下不同水解時(shí)間對(duì)食品中含硫氨基酸含量測(cè)定結(jié)果的影響 單位：g/100g

表4 0 ℃下不同水解時(shí)間對(duì)食品中含硫氨基酸含量測(cè)定結(jié)果的影響 單位：g/100g

從表4中看出，采用0 ℃長時(shí)間氧化法，氧化時(shí)間不足16 h時(shí)，隨著氧化時(shí)間的延長，玉米粉中的胱氨酸含量和全蛋粉中的蛋氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果有所升高，其余基質(zhì)樣品的含硫氨基酸含量的檢測(cè)結(jié)果沒有明顯的升高；當(dāng)氧化時(shí)間為16 h時(shí)，各基質(zhì)樣品中胱氨酸和蛋氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果最高；繼續(xù)增加氧化時(shí)間，黃豆、鯉魚肉、玉米粉中的胱氨酸含量和全蛋粉中的蛋氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)了降低的趨勢(shì)，分析原因可能是氧化的產(chǎn)物與樣品基質(zhì)中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了降解。

通過以上分析，選擇70 ℃下氧化5 min、50 ℃下氧化5 min、0 ℃下氧化16 h可以作為各溫度下氧化的最佳條件。

2.3 不同氧化溫度不同時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

本文分別選取實(shí)驗(yàn)得到的0 ℃、50 ℃、70 ℃的最佳條件，測(cè)定5種不同基質(zhì)食品中含硫氨基酸的含量。不同氧化條件對(duì)這5種食品中胱氨酸和蛋氨酸含量檢測(cè)結(jié)果的影響見圖3和圖4。

圖3 不同氧化條件對(duì)食品中胱氨酸含量測(cè)定結(jié)果的影響Fig.3 The influence of different oxidation conditions on the determination of cystine content in food

圖4 不同氧化條件對(duì)食品中蛋氨酸含量測(cè)定結(jié)果的影響Fig.4 The influence of different oxidation conditions on the determination of methionine content in food

由圖3和圖4可知，不同的氧化條件下這5種基質(zhì)樣品中胱氨酸和蛋氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)不同的反應(yīng)。幾乎所有基質(zhì)的樣品在50 ℃和70 ℃的短時(shí)間氧化條件下測(cè)得的含硫氨基酸含量的結(jié)果差異并不大。但采用0 ℃長時(shí)間氧化條件時(shí)，不同基質(zhì)的樣品得到的含硫氨基酸的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)了分化。當(dāng)0 ℃氧化16 h時(shí)，黃豆和玉米粉中胱氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果略高于50 ℃和70 ℃氧化5 min得到的結(jié)果，而其余4種基質(zhì)樣品中胱氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果則沒有明顯差異；在同樣條件下，全蛋粉和黃豆中蛋氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果明顯高于50 ℃和70 ℃氧化5 min得到的結(jié)果，而其余3種基質(zhì)樣品中蛋氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果沒有明顯差異。曾有研究表明，在溫度較高的情況下，過甲酸中的活性氧會(huì)加速溢出揮發(fā)到空氣中，從而降低溶液中活性氧的含量。同時(shí)，這5種食品中全蛋粉和黃豆的蛋白質(zhì)總量比較高，這有可能是樣品氧化不完全，檢測(cè)結(jié)果偏低的原因[26]。

通過對(duì)不同溫度不同氧化時(shí)間下不同樣品基質(zhì)中含硫氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果的分析，0 ℃下氧化16 h可以取得5種食品中含硫氨基酸含量檢測(cè)的均比較滿意結(jié)果。當(dāng)檢測(cè)周期較短時(shí)，對(duì)于魚肉、嬰幼兒配方奶粉和玉米粉，也可以選用50 ℃氧化5 min作為氧化條件。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

配制磺基丙氨酸和蛋氨酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，磺基丙氨酸通過分子質(zhì)量折算為對(duì)應(yīng)的胱氨酸含量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸計(jì)算求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物含量為此方法該化合物的檢出限，10倍信噪比對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物含量為該化合物的定量限。胱氨酸和蛋氨酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表5。結(jié)果表明，胱氨酸和蛋氨酸都具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.999。

表5 胱氨酸、蛋氨酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、 檢出限和定量限Table 5 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of cysteine and methionine

2.5 回收率和精密度

按照選定條件對(duì)以上5種樣品進(jìn)行了3水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平為樣品中胱氨酸(或蛋氨酸)含量的50%、100%和150%添加，回收率和重復(fù)性結(jié)果見表6。結(jié)果表明，對(duì)于以上5種食品胱氨酸的回收率為85%～102%，蛋氨酸的回收率為82%～94%，5種樣品胱氨酸和蛋氨酸加標(biāo)回收率的RSD均小于5%，方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好。

2.6 樣品的測(cè)定

選擇16個(gè)不同的樣品按照選定條件測(cè)定樣品中含硫氨基酸的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

3 結(jié)論

綜上，氧化劑配制比例、氧化溫度、氧化時(shí)間3個(gè)因素對(duì)于文中涉及的5種食品中含硫氨基酸含量的檢測(cè)結(jié)果均有不同的影響。首先，過甲酸中雙氧水的占比并非越高越好，應(yīng)保持適度。其次，由于氧化產(chǎn)物可能與食品中其他物質(zhì)反應(yīng)，氧化時(shí)間也不是越長越好。最后，測(cè)定魚肉、嬰幼兒配方乳粉和玉米粉中含硫氨基酸的含量時(shí)，采用50 ℃和70 ℃也可以得到較好的氧化效果，同時(shí)縮短氧化時(shí)間。通過對(duì)本文選取氧化條件的重復(fù)性、準(zhǔn)確性、線性關(guān)系、檢出限和回收率的驗(yàn)證，對(duì)于大多數(shù)食品基質(zhì)，選取雙氧水與甲酸體積比為1∶9、氧化溫度為0 ℃時(shí)氧化16 h的氧化條件，可以得到較好的檢測(cè)結(jié)果。

表6 五種食品中胱氨酸、蛋氨酸含量測(cè)定的加標(biāo)回收結(jié)果Table 6 Recovery results for determination of cysteine and methionine in these five kinds of food

表7 不同食品中含硫氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果Table 7 Determination results of sulfur-containing amino acids in different foods

通過本文的數(shù)據(jù)可以看出，由于這5種食品的基質(zhì)差異較大，產(chǎn)生的影響是不完全一致的。食品基質(zhì)非常復(fù)雜，不同食品中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和含量不同，各基質(zhì)食品中的脂肪、碳水化合物、氯化物等含量也不相同，食品基質(zhì)中的哪類物質(zhì)是對(duì)氧化效果產(chǎn)生較大影響的因素還需進(jìn)一步探索研究。