QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花椒中烯效唑殘留量及貯藏穩(wěn)定性

范金平,張盈，魏進*,羅世霞,段婷婷*

1(貴州師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，貴州 貴陽，550009)

香辛料是指在菜品中起調(diào)香、調(diào)味、著色的植物香料，具有香、辛、麻、辣等特點，其在日常生活中是不可缺少的調(diào)味料。花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxin)是香辛料的一種，屬蕓香科落葉小喬木或灌木，是我國“八大調(diào)味品”之一，也是一種中藥材，有殺蟲、散寒、除濕的功效[1]。

烯效唑(uniconazole)又名特效唑，結(jié)構(gòu)式見圖1，是一種光譜性唑類植物生長調(diào)節(jié)劑，赤霉素合成抑制劑，具有控制營養(yǎng)生長，抑制細(xì)胞伸長，縮短節(jié)間、矮化植株，促進側(cè)芽生長和花芽形成的作用[2]，因此能提高作物的抗倒伏能力，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)[3-4]。由于目前在水稻、花生、小麥、大豆、大麥等作物上的廣泛應(yīng)用，造成在植物源性食品中該類農(nóng)藥的殘留。如果食用，短時間內(nèi)影響不明顯，但如果長時間攝入會對人體的血液、肝臟，腎臟造成危害[5]，導(dǎo)致人體代謝失調(diào)，誘發(fā)多種疾病[6]，并可能引起癌變。

我國對烯效唑的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)只在谷物類和油料油脂類上規(guī)定，在花椒上暫時沒有制定[7]，歐盟(European Union,EU)和國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)均未制定烯效唑在農(nóng)產(chǎn)品中的MRL值。目前關(guān)于烯效唑殘留檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-10]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[11]、液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)[12]和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectromentry，UPLS-MS/MS)[3,13]等；GC和GC-MS需要更換溶劑，操作比較復(fù)雜；HPLC受基質(zhì)干擾較大；HPLC-MS/MS具備樣品前處理簡單、靈敏度高、定性能力好等特點。上述方法主要涉及水果、蔬菜、煙草等，而檢測花椒中烯效唑殘留方法以及烯效唑在花椒中的貯藏穩(wěn)定性未見報道。于是，本研究運用了改進的QuEChERS選用不同提取劑(乙腈、含有體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸的乙腈)、不同種類的凈化劑(PSA、C18、C18+GCB、PSA+GCB)，結(jié)合UHPLC-MS/MS分析方法檢測鮮花椒、干花椒中烯效唑殘留，同時研究花椒中烯效唑在冷凍條件下的貯藏穩(wěn)定性。本文通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件，考察了不同流動相、不同前處理方法及基質(zhì)效應(yīng)等因素，建立了UPLC-MS/MS法檢測花椒中烯效唑殘留以及烯效唑在花椒中的貯藏穩(wěn)定性。為烯效唑在花椒中殘留監(jiān)控和質(zhì)量安全評價提供技術(shù)支撐，同時為中國制定花椒中烯效唑的合理使用準(zhǔn)則以及其MRL標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

圖1 烯效唑結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of uniconazole

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

烯效唑(98.7%)標(biāo)準(zhǔn)品，國家農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)檢中心；乙腈(色譜純)，德國默克公司；乙腈(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸(色譜純)，美國Thermo Fisher科技有限公司；乙酸(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

UItimate 3000/TSQ Vantage型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，美國Thermo Fisher 公司；Hypersil GOLD 型C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，賽默飛科技(中國)有限公司；CK200型高通量組織研磨器，北京托摩根生物有限公司；電子分析天平(精度為0.000 1 g)，德國Sartorius公司；多管渦旋儀，杭州瑞誠儀器有限公司；TG16-11型臺式高速離心機，湖南平凡科技有限公司；0.22 μm有機濾膜，日本島津公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取烯效唑標(biāo)準(zhǔn)品0.010 1 g (精確到0.000 1 g)，用色譜純乙腈配制10 mL 1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于4 ℃冰箱中。取烯效唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用色譜純乙腈稀釋制得烯效唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為2.0、0.8、0.2、0.08 mg/L。

1.3 設(shè)計試驗

根據(jù)NT/T3094—2017《植物源農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲藏穩(wěn)定性試驗準(zhǔn)則》[14]設(shè)計試驗?；ń分邢┬н虻馁A藏穩(wěn)定性試驗是在空白花椒樣品加入一定質(zhì)量濃度的烯效唑，再將樣品放入-20 ℃冰箱中保存，不同貯藏時期時對樣品進行檢測，測定花椒中烯效唑的穩(wěn)定性。

1.3.1 制備貯藏穩(wěn)定性試驗樣品

稱取2.0 g空白花椒樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入0.5 mL 2.0 mg/L的烯效唑溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，蓋上蓋子后混勻，每個貯藏期取2個樣品及3個空白樣品，2 h內(nèi)放入-20 ℃冰箱中貯藏。

1.3.2 質(zhì)控樣品

質(zhì)控樣品是在空白樣品中加入與貯藏樣品體積相同、質(zhì)量濃度相同的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個時期設(shè)置2個質(zhì)控樣品。

1.4 樣品的檢測

1.4.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g(精確到0.01 g)均質(zhì)花椒試樣于50 mL塑料離心管，加入2.0 mL屈臣氏蒸餾水和20 mL含0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈溶液，渦旋振蕩1 h，加入2.00 g無水MgSO4、1.00 g NaCl混勻，渦旋振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL到2 mL 離心管(裝有25 mg PSA和100 mg GCB)中，渦旋2 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm的有機濾膜，取濾液接體積比1∶1加屈臣氏蒸餾水后供UPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜與質(zhì)譜條件

Hypersil GOLD 型C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速：0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%的甲酸水；洗脫程序：0～0.5 min 80% B；0.5～1.0 min 80%～5% B；1.0～4.0 min 5% B；4.0～4.5 min 5%～80% B；4.5～5.0 min 80% B。

ESI離子源，掃描方式為MRM多反應(yīng)監(jiān)測，毛細(xì)管電壓：3.2 kV，離子源溫度：350 ℃，脫溶劑溫度：330 ℃，輔助氣(N2)流速：10 arb，鞘氣(N2)流速：30 arb，碰撞氣為氬氣。烯效唑定性、定量離子對等質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 烯效唑的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention times and MS/MS parameters of uniconazole

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

由于液質(zhì)聯(lián)用以及花椒基質(zhì)的復(fù)雜性，考察了基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)的影響。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法來測定花椒的基質(zhì)效應(yīng)即分析了空白花椒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以二者的斜率比來判定基質(zhì)效應(yīng)的強弱[15],如公式(1)所示：

(1)

式中:Sm為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ss為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[15]。

當(dāng)ME為0時，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)ME為-20%～20%時表明存在弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME為-50%～-20%或20%～50%時表明存在中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME≤-50%或>50%時表明存在強基質(zhì)效應(yīng)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的確定

烯效唑結(jié)構(gòu)中含有羥基易于離子化，適合采用ESI源。試驗采用直接進樣方式，在ESI+模式下找到烯效唑母離子，然后通過碰撞能量的調(diào)節(jié)選擇相對豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子，分析時再結(jié)合化合物的保留時間，進行定性、定量分析；烯效唑離子對及其對應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

烯效唑在C18色譜柱上保留效果好，采用梯度洗脫，提高單位樣品的分析效率并減少了強保留雜質(zhì)在色譜柱的積累。試驗選擇了甲醇-0.1%甲酸水溶液， 0.1%甲酸水-乙腈組成的流動相體系，研究了不同流動相對烯效唑洗脫效果的影響。以乙腈-0.1%甲酸水為流動相時，烯效唑能獲得較好的色譜峰和穩(wěn)定的信號強度。因此流動相采用0.1%甲酸水-乙腈。

2.2 凈化方法的選擇

2.2.1 提取劑的選擇

QuEChERS方法中，乙腈為常用的提取溶劑[17]，溶解性能好，能夠溶解有機、無機以及氣體等多種物質(zhì)。由于農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的不同，不同pH下對提取效果影響較大，實驗人員在乙腈中加入不同比例的試劑，如乙酸，取得了更好的回收率[18-20]。本實驗提取溶劑選擇乙腈、0.1%乙酸乙腈，比較花椒中烯效唑的加標(biāo)回收率，結(jié)果表明以乙腈為提取溶劑時，鮮花椒、干花椒中烯效唑的平均回收率分別為62.71%、65.43%，低于NY788—2018標(biāo)準(zhǔn)中所允許的回收率范圍(70%～120%)[21]；以0.1%乙酸乙腈為提取溶劑時，鮮花椒、干花椒中烯效唑的平均回收率分別為84.12%、71.50%；因此選擇0.1%乙酸乙腈為提取溶劑。采用不同提取劑(n=6)時，鮮花椒、干花椒中烯效唑的回收率如圖2-A。

2.2.2 凈化劑的選擇

PSA吸附結(jié)構(gòu)中含2個氨基，屬于氨基吸附劑，通過氫鍵能夠除去有機酸、脂肪酸、糖等物質(zhì)；C18是一種非極性、廣譜性的凈化劑，能有效去除提取液中微量的非極性雜質(zhì)；GCB吸附劑表面有極強的吸附性，能夠去除色素。分別以PSA、C18、C18+ GCB，PSA+GCB為凈化劑比較其回收率。鮮花椒采用PSA+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(84.12%)優(yōu)于PSA、C18、C18+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(63.53%、64.82%、68.64%)，干花椒采用PSA+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(71.50%)優(yōu)于PSA、C18、C18+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(66.53%、64.83%、68.92%)，采用不同凈化劑時(n=6)，鮮花椒、干花椒中烯效唑添加回收率如圖2-B。

A-不同提取劑；B-不同凈化劑圖2 不同提取劑、凈化劑鮮花椒和干花椒中烯效唑 加標(biāo)回收率Fig.2 Recovery rates of uniconazole in fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim and dried Zanthoxylum bungeanum Maxim with different extracting solution and purifying agent

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、方法的線性范圍與定量限

采用鮮花椒、干花椒基質(zhì)空白溶液及溶劑配制烯效唑質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的實驗條件下測定，橫坐標(biāo)(x)為標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(ng/mL)，縱坐標(biāo)(y)為相應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，烯效唑的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果顯示，烯效唑在1.0～50.0 ng/mL均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.993 7～0.999 7。通過添加回收實驗，以最小添加濃度作為方法的定量限(limit of quantitation,LOQ)，烯效唑方法LOQ為0.02 mg/kg。

表2 烯效唑的基質(zhì)效應(yīng)、回歸方程、R2和LOQTable 2 Matrix effects、regression equations、R2 and LOQ of uniconazole

2.4 添加回收試驗結(jié)果

結(jié)果(表3)顯示，在0.02、0.05、0.2 mg/kg 3個添加水平下，鮮花椒、干花椒中烯效唑的回收率在71.50%～85.98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)在1.13%～5.36%，表明本方法均有較好的精密度和準(zhǔn)確度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。鮮花椒 (加標(biāo)濃度0.2 mg/kg)的MRM圖譜如圖3所示。

表3 鮮花椒、干花椒中烯效唑的加標(biāo)回收率和RSD (n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSD of fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim、dried Zanthoxylum bungeanum Maxim(n=6)

A-鮮花椒空白；B-0.01 mg/kg烯效唑溶劑標(biāo)；C-0.2 mg/kg鮮花椒添加；D-鮮花椒樣品添加圖3 空白鮮花椒基質(zhì)，烯效唑溶劑標(biāo)和鮮花椒添加，鮮花椒樣品添加色譜圖Fig.3 Chromatography of fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim blank, uniconazole solvent standard and matrix standard, sample with uniconazole in fresh Zanthoxylum bungeanum

2.5 烯效唑在花椒中的貯藏穩(wěn)定性及實際樣品分析

應(yīng)用本研究所建立的方法，測定花椒中烯效唑不同貯藏時間烯效唑的降解率，烯效唑的平均降解率<30%，說明烯效唑在-20 ℃貯藏是穩(wěn)定的，結(jié)果如表4所示。并對貴州省試驗點施用烯效唑的鮮花椒、干花椒末次施藥后70、80、110 d 3個時間點的樣品進行了檢測，結(jié)果如表5所示。

3 結(jié)論

本文建立了同時檢測鮮花椒、干花椒2種基質(zhì)中烯效唑的一種簡便可靠的殘留分析方法。樣品前處理簡單，根據(jù)農(nóng)藥殘留分析的要求，該方法的各種性能指標(biāo)(LOQ、線性范圍、平均添加回收率)均能滿足要求；烯效唑的定量限為0.02 mg/kg，在0.02、0.05、0.20 mg/kg 3個加標(biāo)水平下平均回收率為71.50%～85.98%，RSD為1.13%～5.36%。該方法適用于花椒中烯效唑多殘留的快速、準(zhǔn)確定性和定量分析。

表4 不同時期鮮花椒和干花椒中烯效唑殘留量及降解率 單位：%

表5 烯效唑在鮮花椒和干花椒中的殘留量 單位：mg/kg

用該方法測定了烯效唑在花椒中的貯藏穩(wěn)定性，結(jié)果表明在-20 ℃冷凍條件下烯效唑在花椒中的平均消解率為12.34%～26.59%，均不超過30%。因此，花椒中烯效唑在-20 ℃至少能穩(wěn)定貯藏5個月。