基于GC-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的濃香型白酒分類方法

胡雪，李錦松，唐永清，張良，錢宇, , 3*，趙金松,4*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000)2(瀘州老窖集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川 瀘州，646000) 3(四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，四川 成都，610064)4(川酒集團(tuán)，四川 成都，610000)

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，是以糧物為原料，大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的，具有悠久的歷史，在國內(nèi)外都享有盛譽(yù)[1]。白酒中的風(fēng)味成分含量極低，僅占總質(zhì)量的1%～2%[2]。目前，白酒中已知的風(fēng)味化合物超過1 000種[3]。由于釀造工藝、生產(chǎn)原料、窖藏條件等的不同造就了這些微量和痕量風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量的差異，決定了白酒的風(fēng)格、香型、品質(zhì)。

近年來，GC、GC-MS、電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)、HPLC、近紅外(near infrared spectrometry，NIR)等儀器在酒類飲料研究中廣泛應(yīng)用[4-7]。鑒于GC-MS方法超高的分離能力和對(duì)未知化合物準(zhǔn)確的鑒定能力已被大量應(yīng)用于酒類飲料的摻假識(shí)別[8]、身份鑒別[9]、年份酒鑒定等研究并取得了一定成果[10-12]。但利用GC-MS方法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)濃香型白酒分類的研究還相對(duì)較少。

隨著各種檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟，白酒的檢測(cè)方法已不再阻礙對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)的定性定量研究，找到一種有效的數(shù)據(jù)處理和分析方法才是目前面臨的問題。聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural networks，ANN)和支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法通常是結(jié)合各種檢測(cè)技術(shù)用于食品藥品等的分析研究[13-16]。ZHENG等[17]利用GC-MS結(jié)合PCA和PLS-DA對(duì)不同品牌的濃香型原酒進(jìn)行了有效區(qū)分。WU等[18]利用紫外可見光譜結(jié)合PCA和SVM以及PLS-DA對(duì)不同產(chǎn)地的米酒進(jìn)行區(qū)分，其正確率高達(dá)100%。WU等[19]利用多種同位素和金屬元素結(jié)合多種化學(xué)計(jì)量學(xué)的分析方法能對(duì)進(jìn)口紅酒的產(chǎn)地進(jìn)行有效的驗(yàn)證分析。綜上所述，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合各種檢測(cè)技術(shù)能對(duì)數(shù)據(jù)隱含的更深層次的信息進(jìn)行有效挖掘和分析。

本實(shí)驗(yàn)以6個(gè)不同品牌的31種濃香型白酒為研究對(duì)象，以GC-MS為檢測(cè)手段，利用33種共有風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合HCA、PCA和PLS-DA等化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，分析了濃香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)間的差異，可為濃香型白酒快速分類以及多樣品間風(fēng)味成分比對(duì)分析提供理論依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試驗(yàn)材料為6個(gè)不同品牌的濃香型白酒，所有酒樣均購于京東官方自營旗艦店，樣品具體信息見表1。

表1 濃香型白酒酒樣信息Table 1 The detail of the strong-flavor Baijiu samples

風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級(jí)及以上)：正丙醇、仲丁醇、正丁醇、2-甲基丙醇、乙酸乙酯、乙酸、異戊醛、2-戊酮、丙酸乙酯、異戊醇、正戊醇、丁酸乙酯、正己醇、戊酸乙酯、己酸、己酸乙酯、己醛二乙縮醛、庚酸乙酯、己酸丁酯、丙酸、丁酸、庚酸、辛酸、叔戊醇，天津光復(fù)化學(xué)試劑有限公司；乙縮醛、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、無水乙醇，北京壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；2-甲基丁酸乙酯、丁醛二乙縮醛、乙酸己酯、己酸己酯、十六酸乙酯，百靈威科技有限公司；己酸丙酯、亞油酸乙酯，阿拉丁試劑(上海)有限公司；C7-C40正構(gòu)烷烴，北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ8000三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜、AI1310多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，美國Thermo Fisher Scientific公司；HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 定性分析

結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間指數(shù)(retention index，RI)和NIST 12質(zhì)譜庫進(jìn)行定性分析。

1.3.2 定量分析

白酒中風(fēng)味成分的定量分析方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。將待測(cè)風(fēng)味成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)精確量取并用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，所有待測(cè)風(fēng)味成分的體積分?jǐn)?shù)均為0.02%。在樣品分析前，首先對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，利用峰面積及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量計(jì)算出每種風(fēng)味化合物的校正因子。分別以乙酸正戊酯，2-乙基丁酸，叔戊醇作為酯類、酸類及醇類和其他類別風(fēng)味成分的內(nèi)標(biāo)物。

1.3.3 GC-MS檢測(cè)方法

GC條件：初始溫度為40 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升高至120 ℃，保持1 min，以40 ℃/min速率升高至290 ℃；載氣為He, 柱流量 1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃, 進(jìn)樣量：1 μL，分流比 50∶1。

MS條件：電離方式EI，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線為260 ℃；掃描方式為全掃描；掃描質(zhì)量范圍(m/z)30～550。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用ChemPattern軟件(科邁恩北京科技有限公司)和SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，Excel 2016、Origin 2018軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)和畫圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度和回收率分析

分析酒樣前，進(jìn)空白樣品(甲醇)做對(duì)照。取配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)6次平行測(cè)試，統(tǒng)計(jì)任意一個(gè)風(fēng)味成分的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)<2%，峰保留時(shí)間的 RSD 值均< 0.1%。在樣品風(fēng)味成分定量結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率為90.83%～104.35%，表明實(shí)驗(yàn)儀器穩(wěn)定且根據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的結(jié)果可信。

2.2 風(fēng)味物質(zhì)的定性與定量

利用GC-MS，采取直接進(jìn)樣的方式，在15 min內(nèi)共檢測(cè)到112種化合物。在扣除乙醇峰后，利用面積歸一化法，以峰高>0.5%為界，共篩選出33種含量較高的風(fēng)味成分作為研究對(duì)象進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表2。其中酯類14種，醇類8種，酸類6種和5種醛酮類物質(zhì)。酯類是濃香型白酒中的主要呈香物質(zhì)，具有令人愉悅的水果香氣[20]，以己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯為主，但在不同品牌的酒樣中4類酯的含量差異較大，JSY和YJGJ中己酸乙酯的含量相較于其他品牌略低，YJGJ酒樣中乙酸乙酯含量相較于其他品牌稍低，所有樣品的乳酸乙酯和丁酸乙酯的含量相差不大。醇類為發(fā)酵過程中氨基酸脫氨或糖脫羧產(chǎn)生[21]，在6個(gè)品牌中WLY、YH、JSY樣品中的醇類物質(zhì)含量相較于SXTB、LZLJ更高。酸類則為糖類發(fā)酵的產(chǎn)物[20]，濃度較低時(shí)具有一定的奶酪香氣，能夠增加白酒香氣的復(fù)雜性，而濃度較高具有明顯的酸敗味。由表2可知，不同品牌樣品的酸類物質(zhì)在含量上相差不大，以乙酸和己酸為主。以乙縮醛為代表的羥基類化合物大量存在于樣品中，主要是對(duì)風(fēng)味及口感有影響[20]，研究對(duì)象中WLY和YH酒樣的羥基類化合物略高于其他品牌白酒。然而，從測(cè)試結(jié)果統(tǒng)計(jì)來看，單一或者多種風(fēng)味成分的含量及量比關(guān)系并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)白酒品牌的區(qū)分和鑒別，因此，需要借助其他數(shù)據(jù)分析手段對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行挖掘以獲得更多的可用信息來得到更好的分類效果，如PCA，HCA，ANN，PLS-DA等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段。

表2 不同品牌酒樣中風(fēng)味物質(zhì)含量Table 2 The content of flavoring compounds in different brands of liquor samples

2.3 聚類分析

HCA是將研究對(duì)象按照相似度進(jìn)行自然聚集的一種技術(shù)，為一種無監(jiān)督模式識(shí)別方法，是將研究對(duì)象分為相對(duì)同質(zhì)群組的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，以33種風(fēng)味物質(zhì)含量為變量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，其聚類分析結(jié)果顯示(圖1)，6個(gè)品牌的31個(gè)濃香型白酒被聚成2大類和6個(gè)小類，相同品牌不同類別的酒樣能按照品牌單獨(dú)聚集為一類，不同品牌間樣品具有明顯差異，說明聚類分析對(duì)濃香型白酒區(qū)分具有一定的指導(dǎo)意義。

2.4 主成分分析

PCA是一種在無監(jiān)督模式下對(duì)多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法[23]。在對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行PCA之前，使用相關(guān)系數(shù)矩陣對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行適應(yīng)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示33種風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明酒樣中的風(fēng)味物質(zhì)間的相關(guān)性較強(qiáng)，能用PCA方法對(duì)其進(jìn)行處理。利用PCA對(duì)樣品的33種共有風(fēng)味成分進(jìn)行分析，其中前3個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)值為72.95%，基本保留了原來變量的信息。由PC1、PC2、PC3的得分構(gòu)建的三維和二維散點(diǎn)圖(圖2)可知，6個(gè)不同品牌的濃香型白酒能被較好分類，每個(gè)品牌間樣品的聚集程度與HCA得到的結(jié)果一致，表明在對(duì)白酒品牌的鑒別時(shí)，PCA和HCA可以相互驗(yàn)證。

圖1 不同品牌濃香型白酒的聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis in different brands of strong-flavor Baijiu samples

a-PC1，PC2，PC3三維散點(diǎn)圖；b-PC1，PC2散點(diǎn)圖；c-PC1，PC3散點(diǎn)圖圖2 不同品牌濃香型白酒PCAFig.2 The PCA in different brands of strong-flavor Baijiu samples

2.5 偏最小二乘判別分析

在HCA和PCA的分析結(jié)果上，進(jìn)一步利用PLS-DA對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的線性分類方法，該模型適用于多自變量并且強(qiáng)線性情況的分析和預(yù)測(cè)，能從數(shù)據(jù)內(nèi)部的角度來解釋所提取的主因子[24]。對(duì)6個(gè)品牌的濃香型白酒進(jìn)行PLS-DA，提取的3個(gè)成分變量信息占總原始變量信息的74.19%，表明這3個(gè)成分可反映白酒中風(fēng)味物質(zhì)的總體情況。利用前3個(gè)成分的得分做三維散點(diǎn)(圖3)，可得，PLS-DA的分類結(jié)果與HCA，PCA結(jié)果相似，都對(duì)研究樣品進(jìn)行有效鑒別和分類。隨機(jī)從6個(gè)品牌中任意挑選1個(gè)樣品作為 “測(cè)試集”，其余的25個(gè)酒樣作為“訓(xùn)練集”，對(duì)測(cè)試集樣本做判別，用判定結(jié)果與實(shí)際情況對(duì)比。判別結(jié)果如圖4所示，測(cè)試集樣本的預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率為100%，能有效地對(duì)不同品牌的酒樣進(jìn)行分類和鑒定。

圖3 不同品牌濃香型白酒PLS-DAFig.3 The PLS-DA in different brands of strong-flavor Baijiu samples

圖4 PLS-DA預(yù)測(cè)分類結(jié)果Fig.4 PLS-DA predictive classification result

2.6 不同品牌濃香型白酒風(fēng)味差異原因分析

本次試驗(yàn)利用33種共有風(fēng)味物質(zhì)，多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能將6個(gè)不同品牌的酒樣有效分類。同時(shí)，在HCA、PCA和PLS-DA分析中，6個(gè)品牌按照接近程度可以概括為2大類：WLY和YH為一類，剩余樣品為一類。WLY與YH的酒樣更相近，而與同一產(chǎn)區(qū)的LZLG相距較遠(yuǎn)，造成這種現(xiàn)象的原因可能有以下幾個(gè)方面：(1)生產(chǎn)原材料[25]。LZLG白酒釀造原料主要以單糧(高粱)為主，而WLY和YH等多采用多糧，原料包括高粱，大米，小麥，玉米，糯米等，但彼此之間的混合比例在不同酒廠也有差異，導(dǎo)致最終的風(fēng)味和口感也稍有差異。(2)釀造工藝[26]。以LZLJ為例，LZLJ采用原窖法釀造，窖香濃郁，風(fēng)味統(tǒng)一；WLY采用跑窖法，曲香、糧香突出，窖香偏弱；洋河采用“混蒸混燒、蒸五下四”的老五甑發(fā)酵工藝，酒質(zhì)偏甜，綿性好。(3)窖池及其微生物群落等[27]。發(fā)酵用的窖池及其微生物群落的差異也會(huì)造成白酒風(fēng)味存在一定差異，而微生物群落的分布與地質(zhì)、水源、氣候、環(huán)境、溫度等密切相關(guān)。因此，造成不同品牌白酒風(fēng)味差異的因素有很多，但每個(gè)品牌獨(dú)特的原料配方及釀造工藝造就了每個(gè)白酒的特有風(fēng)味和口感，因而，本文從白酒風(fēng)味成分入手，利用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，能將不同品牌白酒進(jìn)行有效區(qū)分和鑒別。

3 結(jié)論

采用GC-MS直接進(jìn)樣的分析方法對(duì)市售暢銷的不同品牌濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量研究，具有簡(jiǎn)單，快速，經(jīng)濟(jì)且對(duì)樣品無損的優(yōu)點(diǎn)。利用33種共有風(fēng)味物質(zhì)對(duì)所有樣品進(jìn)行HCA、PCA和PLS-DA。HCA，PCA能將6個(gè)不同品牌的酒樣進(jìn)行有效分離。PLS-DA也能將6個(gè)品牌的酒樣區(qū)分開，且在判定結(jié)果中測(cè)試樣本與訓(xùn)練樣本的正確率均為100%。因此，利用GC-MS的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合多種化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法能對(duì)不同品牌的濃香型白酒進(jìn)行有效的分類和鑒定。