雙水相萃取黃漿水酯化液中的酯類風味物質

李亞男，楊銘，陳正行*，羅小虎，萬盈

1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室 (江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

黃漿水是白酒固態(tài)發(fā)酵過程中，沉積在窖池底部的棕黃色黏稠液體，含有酒精、水分及各種香味物質等[1-2]。將黃漿水酯化用于白酒勾兌，不僅能彌補白酒風味成分的不足，還能避免人工添加香精產生的“浮香”問題[3-4]。但黃漿水酯化液中水的含量在90%以上，如何提取酯類物質是應用的關鍵。目前常見的提取方法有蒸餾[5]和超臨界CO2流體萃取[6]，該現有方法均存在設備投入大，萃取成本高[7-8]，無法滿足實際生產應用的問題。

雙水相體系如乙醇/異丙醇/丙酮等親水有機溶劑和水的混溶體系在(NH4)2SO4、Na2CO3、K2HPO4、NaH2PO4、K3PO4等無機鹽的作用下出現分層以達到分離作用。PRATIWI等[9]利用乙醇/硫酸銨體系萃取琥珀酸；XU等[10]利用1,4-二惡烷/Na2SO4體系萃取乳酸；姚譽陽等[11]采用PEG-NaH2PO4體系萃取頭孢呋辛酯。雙水相萃取具有較高的生物相溶性、易于放大、可連續(xù)化操作，已經應用于蛋白質、核酸、氨基酸、抗生素以及色素等產品的分離和純化，必將在生物工程、食品等領域廣泛應用[12-14]。

本文采用雙水相萃取分離提取洋河酒廠黃漿水酯化液中的酯類，利用酯化液中本身含有的乙醇進行成相，研究確定最合適的萃取用鹽，優(yōu)化雙水相的萃取工藝。范文來等[15]研究表明，綿柔型白酒的關鍵風味酯類有己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸乙酯，并考察了該5種風味酯類在雙水相體系中的分配系數和萃取率。對萃取液進一步處理得到調味液粗產品，與黃漿水的理化性質和天之藍白酒的風味成分對比，考察雙水相萃取酯類的效果?；谠撗芯繛辄S漿水酯化液的高效利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水，江蘇洋河酒廠；黃漿水酯化液，酯化制備；NaH2PO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、無水乙醇(均為分析純)，己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、戊酸乙酯(均為色譜純)，國藥沃凱化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2020氣質聯用儀(搭配HS-10自動頂空進樣器)、SH-Rtx-Wax毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，日本SHIMADZU公司。

1.3 風味酯類分析方法

樣品前處理[3]：用去離子水將樣品稀釋10倍，取8 mL加入20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，振蕩使水溶液過飽和，壓緊瓶蓋。

頂空-GC-MS定性分析[16-17]：以SH-Rtx-Wax毛細管色譜柱對樣品進行分離。GC升溫程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速度升溫至90 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持7 min；進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速2 mL/min，進樣量1 μL，不分流進樣；MS條件：EI，電離能量70 eV，燈絲電流設定值 120 μA；離子源溫度200 ℃，掃描方式：SIM。

頂空-氣相法定量分析：DB-Wax毛細管色譜柱對樣品進行分離，檢測器為FID氫火焰離子檢測器，外標法定量。自動頂空進樣器程序：恒溫爐60 ℃，樣品流路溫度100 ℃，傳輸線溫度100 ℃，GC循環(huán)35 min。

1.4 無機鹽/乙醇雙水相平衡相圖的繪制

采用濁點滴定法[18]：取50 mL具塞刻度試管若干，加入10 mL去離子水；準確稱取不同質量的無機鹽分別加入試管中，渦旋使之充分溶解，形成不同質量分數的無機鹽-水溶液；將無水乙醇注入酸式滴定管，對無機鹽-水溶液進行滴定，以氣泡消失溶液恰好變?yōu)槿闈嵋簽榈味ńK點，記下無機鹽的質量m以及對應的乙醇消耗量V。以無機鹽質量分數為橫坐標軸，濁點乙醇體積分數為縱坐標軸，繪制平衡相圖。

1.5 雙水相體系中相比、分配系數和萃取率的測定

結合參考文獻[18-19]，改進試驗方法和計算公式，準確稱取不同質量的無機鹽(精確到0.000 1 g)，置于20 mL具塞刻度試管中；加入黃漿水酯化液15 g，使每只試管的總體積約為15 mL，形成不同鹽濃度梯度(根據相圖，鹽濃度高于最低加鹽量)的萃取體系；渦旋振蕩5～10 min使無機鹽充分溶解并與酯化液充分混合，靜置過夜；待分層充分穩(wěn)定后，分別讀取上下相的體積，計算相比R；分別吸取上下相0.8 mL，稀釋10倍，對5種主要風味酯類(己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸乙酯)的濃度進行定量分析，相比R、各酯類分配系數K、萃取率Y計算如公式(1)～公式(3)所示：

(1)

(2)

(3)

式中：Vt、Vb，分別為上下相的體積，mL；Ct、Cb，分別為酯化物在上相和下相中的質量濃度，mg/L。

1.6 萃取液進一步脫水除雜

用分液漏斗分離萃取后得到上相液體，緩慢添加無水Na2SO4粉末直至不再產生絮狀沉淀，再加少量無水Na2SO4，振蕩后靜置過夜；離心棄去沉淀，硅藻土過濾后即為調味液粗產品(簡稱調味液)，測定調味液的理化指標和風味成分。

2 結果與分析

2.1 雙水相體系的選取

根據預實驗選取成相較好的4種無機鹽K2HPO4、NaH2PO4、Na2CO3、(NH4)2SO4，分別繪制與乙醇的相平衡關系相圖，如圖1所示。實線以上是兩相區(qū)，以下是均相區(qū)；圖中虛線是相圖的連接線，上相T主要含乙醇，下相B主要含無機鹽。點M表示體系分相后，上相體積與線段TM的乘積等于下相體積與線段MB的乘積。當乙醇含量一定時，無機鹽的含量越高，相比R(即MB/TM)越小，上相所含乙醇越多無機鹽越少，下相則相反。當連接線越偏離曲線時，上下相組分差異越大，則有更好的分離效果；當平衡曲線的曲率越大，偏離連結線的程度越深，分相越快越明顯。K2HPO4的平衡曲線彎曲程度最深，Na2CO3次之，(NH4)2SO4的平衡曲線最接近連接線。另外，K2HPO4的溶解度較大(20 ℃，62 g/100g水)，可控范圍較廣，20 ℃左右溶解性平穩(wěn)，雙水相體系受溫度的影響較小。Na2CO3在20～30 ℃溶解度相差20 g左右。因此，選用分相能力最強、性質較穩(wěn)定的K2HPO4作為雙水相萃取的分相用鹽，這與范蕊慶等[20]和ZHANG等[12]選取的萃取鹽相同。

2.2 雙水相萃取酯化液中風味酯類的工藝優(yōu)化

2.2.1 K2HPO4濃度對雙水相萃取酯類的影響

酯化液的乙醇體積分數為20%左右，加入不同質量分數的K2HPO4，考察K2HPO4濃度對相比R、分配系數K和萃取率Y的影響。由圖2可知，隨著K2HPO4質量分數的增大，相比R急速下降后趨于平緩，5種酯類物質的分配系數K隨之增大，萃取率Y呈先上升后下降的趨勢，在無機鹽質量分數為80%左右時達到最大值，5種酯類的萃取率均達到90%～99%。當K2HPO4的濃度較低時，與乙醇爭奪水分子的能力較弱，使得大量的水分聚集在上層，上下相組分差異較小，極性相差不大，對酯類選擇性不強，分配系數相對較低；隨著K2HPO4濃度升高，鹽析效應和結合水能力增強，K2HPO4奪走了酯類周圍的水分子而將酯類排擠出水相(鹽相)而進入上相(乙醇相)，相比R下降，上下相組分差異增大，對酯類的選擇性增強，分配系數K也顯著增大[8]。

不同酯類K值的大小關系為：辛酸乙酯>己酸乙酯>戊酸乙酯>丁酸乙酯>乙酸乙酯，這與它們的極性呈負相關，溶劑的極性代表疏水力的強弱，極性越強越易溶于水，而極性越弱則較為難溶而易于分層。一般情況下，可以用介電常數來度量溶劑相對極性的強弱，結合表1中5種酯類化合物的介電常數和溶解性[21]，驗證了雙水相體系對酯類的分離效果取決于其疏水作用的強弱。

a-K2HPO4/乙醇；b-(NH4)2SO4/乙醇；c-Na2CO3/乙醇；d-NaH2PO4/乙醇圖1 無機鹽/乙醇雙水相體系相圖Fig.1 Phase diagram of inorganic salt/ethanol aqueous system

a-相比R；b-分配系數K；c-萃取率Y圖2 K2HPO4質量分數對雙水相體系相比R、分配系數K和萃取率Y的影響Fig.2 Effect of the K2HPO4 mass fraction on the phase ratio R, the partition coefficient K and the extraction rate Y in aqueous two-phase system

表1 五種酯類化合物的相對介電常數和溶解性Table 1 Relative permittivity and solubility of five ester compounds

2.2.2 pH對雙水相萃取酯類的影響

酯化液含有未被酯化的有機酸，其pH值在4.5左右，調節(jié)pH值至3.5、4.5、6.0、7.5、8.5、9.5、10.5，加入質量分數為80%的K2HPO4，考察不同pH對相比R和己酸乙酯的分配系數K的影響，如圖3所示。pH對相比R和己酸乙酯分配系數K無顯著影響。古博華[19]研究表明硫酸銨/丙酮雙水相體系萃取丁二酸中，萃取率隨pH值增大而減小，可能緣于pH值的增大使越來越多的丁二酸生成鹽，易溶解于水相(下相)而幾乎不溶于丙酮；而本文中H+濃度并不影響酯類在體系中的存在形式，且萃取鹽K2HPO4是緩沖鹽，酯化液中有機酸含量較低，K2HPO4本身具有穩(wěn)定pH的性質，因此，選擇雙水相體系的pH值為4.5。

圖3 不同pH對雙水相體系的相比R和己酸乙酯的 分配系數K的影響Fig.3 Effect of pH on the phase ratio R and the partition coefficient K of ethyl hexanoate in aqueous two-phase system

2.2.3 乙醇含量對雙水相萃取酯類的影響

雙水相體系中K2HPO4質量分數為80%，酯化液中原乙醇體積分數為20%，考察添加無水乙醇的含量對R、K和Y的影響。如圖4所示，隨乙醇含量增大，上相的體積也隨之增大，相比R增大；K值隨乙醇的含量增大而上升，當乙醇添加量達20%后趨勢平緩；乙醇含量的增加對酯類的萃取效果有一定影響[18]，除極性較大的乙酸乙酯萃取率從93%提高至99%，4種酯類萃取率均變化不大，為95%～100%。添加乙醇對上相有稀釋作用，酯類的濃度隨之降低，對萃取率無顯著提升的作用，考慮到節(jié)省溶劑，避免后續(xù)去除溶劑對酯類造成的損失，雙水相體系應不添加額外乙醇，以酯化液中乙醇體積分數20%為較優(yōu)條件。

a-相比R；b-分配系數K；c-萃取率Y圖4 乙醇添加量對雙水相體系相比R、分配系數K和萃取率Y的影響Fig.4 Effect of ethanol content on the phase ratio R, the partition coefficient K and the extraction rate Y in aqueous two-phase system

綜上所述，本文確定了雙水相萃取酯化液中風味酯類的較優(yōu)工藝為：酯化液15 g，K2HPO4質量分數為80%，乙醇體積分數為20%，pH值為4.5，在該條件下，5種酯類的萃取率均達到90%～99%，這與XU等[10]的乳酸萃取率最高達91%和姚譽陽等[11]的頭孢呋辛酯萃取率92%的萃取效果接近；該萃取率高于裴瑩等[22]的α-酮戊二酸萃取率80.45%和PRATIWI等[9]的琥珀酸萃取率82%，證明了雙水相體系對酯化液中的酯類有較好的萃取效果。

2.3 調味液理化性質和風味化合物分析

2.3.1 黃漿水和調味液理化性質分析

黃漿水和調味液的基本理化性質如表2所示，黃漿水酯化、萃取和脫水處理后，水分含量從91.11%降低至1.14%，乙醇含量高達98.96%，萃取效果顯著，用該調味液進行勾兌不會降低基酒的酒精度；調味液總酯含量(67.85 g/L)顯著高于黃漿水(1.37 g/L)，總酸幾乎未檢出。此外，在雙水相萃取的過程中，殘余蛋白、糖類、淀粉、醛類等含有親水基團被留在下相而去除；單寧及色素等多酚類物質更易溶于醇相而被富集[3]。

表2 黃漿水和調味液的理化性質Table 2 The physical and chemical properties of yellow water and the blending liquid

2.3.2 萃取液、調味液和洋河白酒風味成分的對比

由表3可知，雙水相萃取有效地富集了風味酯類、醇類和一些酚類化合物，萃取液和調味液的酯類質量濃度顯著高于酯化液，且萃取液中5種酯類的質量濃度是酯化液的3～5倍；另外，萃取液和調味液中有機酸均未檢出；部分短鏈有機酸易溶于水相被除去，另外，成相用鹽K2HPO4是弱堿性鹽，與有機酸生成的鹽易溶于水相而被去除。

將調味液的風味成分(表3)與洋河天之藍白酒[3]對比，調味液的風味酯類總量明顯高于白酒，關鍵風味酯類丁酸乙酯(105.08 mg/L)、辛酸乙酯(232.97 mg/L)的含量遠高于白酒，己酸乙酯(1 350.47 mg/L)、戊酸乙酯(26.83 mg/L)的含量和白酒接近，乙酸乙酯(30.72 mg/L)的含量略低于白酒，這與酯類極性對分配系數影響的結果一致，有機酸幾乎未檢出，調味液具有較強的菠蘿型、水蜜桃型等甜果香氣而無腐臭、惡臭等不愉快的氣味[15-17]，可以彌補酸化基酒中酯類風味物質的不足，以提高酒的風味。

表3 酯化液、萃取液和調味液風味化合物的質量濃度 單位：mg/L

3 結論

本文采用雙水相萃取的方法分離提取酯化液中的風味酯類，選用成相迅速、溶解范圍廣泛的K2HPO4為萃取用鹽，研究發(fā)現隨著無機鹽濃度的升高，酯類的相比顯著下降，分配系數先增大后趨于不變，萃取率先增大后減??；分配系數與酯類疏水性有關，極性越強分配系數越小。較優(yōu)的酯類萃取條件為：K2HPO4質量分數為80%，pH值為4.5，乙醇體積分數為20%，在該萃取條件下，5種酯類的萃取率均達到90%～99%，且萃取液中5種酯類的質量濃度是酯化液的3～5倍。萃取液用無水Na2SO4進一步脫水得到調味液，調味液的酯類含量明顯高于黃漿水和市售天之藍白酒，且不含有機酸，適合酸化基酒的勾兌。另外，在雙水相萃取過程中，殘余蛋白、糖類、淀粉、醛類等含有親水基團的物質留在水相而去除，達到了除雜的效果；綜上所述，本文首次將新型的雙水相應用于黃漿水酯化液中酯類的萃取，為黃漿水的實際應用奠定了理論基礎，具有一定的價值。