一株紅樹林來源稀有放線菌的鑒定和抑菌活性物質(zhì)的初步研究

張駿梁，張詩玲，吳佳慧，許姍姍，梁錦有，徐穎*

1(深圳大學 生命與海洋科學學院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，深圳市海洋藻類生物開發(fā)與應用工程實驗室， 廣東 深圳，518060)2(深圳大學 物理與光電工程學院，光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點實驗室，廣東 深圳，518060) 3(中國藥科大學 工學院，江蘇 南京，211198)

細菌耐藥性的威脅日益嚴重，尋找新型抗菌藥物已迫在眉睫[1]。長期以來，放線菌次級代謝產(chǎn)物一直是微生物藥物的重要來源[2]。但隨著抗生素開發(fā)的“黃金時代”遠去，從陸生或土壤微生物中難以尋找到新的抗菌活性物質(zhì)[3]。于是人們轉(zhuǎn)向研究海洋[4-5]、荒漠[6]或極端環(huán)境微生物[7]，它們長期生長于特殊環(huán)境下，形成了較為獨特的生理代謝途徑，具有產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物的潛力。

我們從香港米埔濕地紅樹林植物的根際沉積物中，分離到1株放線菌XY-R10，初步鑒定為擬孢囊菌屬[8]的Kibdelosporangiumphytohabitans(K.phytohabitans)，為1株稀有放線菌。該菌公開的基因組大小為11.76 Mb[9]，使用antiSMASH 5.0對基因組注釋分析[10]，預測有49個生物合成基因簇，說明其具有產(chǎn)生多種活性次級代謝產(chǎn)物的潛能。目前已從擬孢囊菌屬的多株菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的化合物，如Aridicins[11]、Kibdelins[12]、Azicemicins[13]和Kibdelomycins[14]等，而對K.phytohabitans次級代謝產(chǎn)物的研究尚未見報道。我們對菌株XY-R10發(fā)酵粗提物的抑菌譜和穩(wěn)定性進行了研究，結(jié)合液相-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem high-resolution mass spectrometry,LC-HRMS)分析粗提物中的成分，以期為該菌具有抑菌活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘和開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

紅樹林植物秋茄[Kandeliacandel(L.) Druce]，中國香港，米埔內(nèi)后海灣拉姆薩爾國際重要濕地(E 114.05°，22.49°)；以無菌操作法，取根際3～5 cm深的沉積物，裝入無菌密封袋中，帶回實驗室在24 h內(nèi)完成處理。

1.1.2 抗菌活性測試用菌株

金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)ATCC 25923、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)ATCC 43300、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC 29212、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)ATCC 35667、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 6051、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)ATCC 12228、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)ATCC 13813、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19115、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAO1、大腸桿菌(Escherichiacoli)O157:H7、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)CMCC 50335、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)ATCC 17802，均為本實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

TSB、MH、BHI肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，肉湯中添加1.8%～2%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂為固體培養(yǎng)基；R2A、ISP-2培養(yǎng)基，美國BD DifcoTM公司。

斜面孢子培養(yǎng)基：ISP-2培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，玉米淀粉10，黃豆餅粉10，硫酸銨2，玉米漿干粉5，去離子水1 L，pH(7.2±0.1)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20，甘油20，Peptone 20，人工海鹽20，碳酸鈣5(調(diào)整pH后加入)，去離子水1 L，pH (7.5±0.1)。

1.1.4 主要試劑

Peptone、Yeast Extract，英國OXIOD公司；人工海鹽，廣州益爾生物工程有限公司；Ezup 柱式細菌基因組 DNA 抽提試劑盒(B518255)、SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒(B518131)，生工生物工程(上海)股份有限公司；Collismycin A、Maipomycin B和Collismycin X，深圳金普邁生物科技有限公司；C18硅膠填料(50 μm，120 ?)，蘇州納微科技股份有限公司；其他化學試劑，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(DAD檢測器)，日本島津公司；Agilent 1260/6545 Q-TOF液質(zhì)(LC-MS)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；Waters 2695-2996制備液相色譜儀，沃特世科技有限公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道爾夫公司；LRH-70恒溫培養(yǎng)箱、THZ-100恒溫搖床，上海一恒科學儀器有限公司；1300生物安全柜，賽默飛世爾科技有限公司；SMZ-168體視顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 放線菌的分離

將沉積物樣品浸泡在無菌海水中配制成混懸液，用梯度稀釋法將混懸液稀釋后，吸取10-2～10-6梯度的稀釋液100 μL均勻涂布于R2A培養(yǎng)基固體平板上，平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～8 d。對平板上長出的菌落進一步劃線分離純化，獲得純培養(yǎng)物，進行分子生物學鑒定，編號并保藏。

1.3.2 菌株16S rRNA序列的測定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

DNA抽提試劑盒提取菌株XY-R10的基因組DNA，用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-T-3′)進行PCR擴增，反應體系為：模板DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP 4 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR循環(huán)條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。將測序結(jié)果上傳到EzBioCloud網(wǎng)站進行比對[15]，下載相似性最高的前10株菌的16S rDNA序列。用MEGA 7.0對這些序列進行比對，Phylogeny中選擇鄰接法構(gòu)建發(fā)育進化樹。

1.3.3 菌株形態(tài)觀察

將菌株XY-R10在ISP-2培養(yǎng)基平板上劃線，另取滅菌蓋玻片斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，平板在28 ℃培養(yǎng)7～8 d后，觀察記錄菌落形態(tài)，并取出長有菌絲的蓋玻片，用結(jié)晶紫染色，油鏡(1 000×)下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.4 放線菌發(fā)酵和產(chǎn)物粗提取

將XY-R10接種于斜面孢子培養(yǎng)基(ISP-2培養(yǎng)基)，28 ℃培養(yǎng)7～8 d后接種到種子培養(yǎng)基搖瓶中，在28 ℃、225 r/min條件下培養(yǎng)42～48 h。種子液按5%接種量接種至發(fā)酵搖瓶，在28 ℃、225 r/min條件下培養(yǎng)6 d。將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10 min 取上清液，上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相減壓濃縮得發(fā)酵粗提物，二甲基亞砜溶解備用。

1.3.5 抑菌活性檢測方法

(1)紙片法測定抑菌活性：參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的藥敏試驗執(zhí)行標準M02-A11進行。

(2)微量稀釋法測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：參照CLSI的藥敏試驗執(zhí)行標準M07-A9和M45-A，用96微孔板測定。

1.3.6 抑菌活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性考察[16]

取發(fā)酵粗提物溶解于水中，分別用0.1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至3、5、7、9、11，未調(diào)節(jié)pH值的粗提物水溶液為陽性對照，未調(diào)節(jié)pH值的水、pH 3和pH 11的水為陰性對照，MRSA為活性指示菌，紙片法檢測調(diào)完pH值后粗提物的抑菌活性，考察不同pH處理對粗提物抑菌活性的影響。另取調(diào)節(jié)為不同pH值的粗提物溶液，在60 ℃ 水浴處理3 h后檢測抑菌活性，考察不同pH處理下粗提物抑菌活性的溫度穩(wěn)定性。

1.3.7 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱ACE Excel 5 C18-HL，250 mm×4.6 mm；流動相A：乙腈；流動相B：V(10 mmol/L甲酸銨)∶V(乙腈)=9∶1；檢測波長200～600 nm；流量1 mL/min；柱溫35 ℃。梯度洗脫：0～20 min，A(0～40%)；20～35 min，A(40%～80%)；35～40 min，A(80%)；40.01～45 min，A(0)。

質(zhì)譜條件：Dual AJS ESI，Auto MS(2) Mode；Gas Temp：325 ℃；Drying gas：10 L/min；Nebulizer：40 psi；Sheath Gas Temp：350 ℃；Sheath Gas Flow：12 L/min；VCap：4 000 V；Nozzle Voltage：500 V。

1.3.8 抑菌活性物質(zhì)初步分離

取發(fā)酵粗提物上樣于C18硅膠柱(徑高比6∶1)，依次用10%～100%(體積分數(shù))甲醇水溶液洗脫，分部分收集洗脫液。各部分洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥為干粉，檢測各分離段的MIC值。

將40%甲醇洗脫的部分用制備液相色譜儀制備Maipomycin A，色譜條件：Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(250 mm×21.2 mm, 5 μm)，V(乙腈)∶V(水)=25∶75，流量為4 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XY-R10的形態(tài)特征

菌株XY-R10在ISP-2培養(yǎng)基上生長良好(圖1-a)，菌落呈圓形凸起，無光澤，表面干燥、有褶皺，貼緊培養(yǎng)基生長，不易挑起。氣生菌絲豐富，為白色或灰白色，體視鏡下能觀察到致密、絨狀的菌絲，具有一般放線菌的特征(圖1-b)。菌落周圍產(chǎn)生黑褐色可溶性色素，擴散在瓊脂中。將其氣生菌絲用結(jié)晶紫染色后在放大1 000倍的油鏡下觀察(圖1-c)，能看到細長、不規(guī)則彎曲的菌絲，菌絲形成長、直或彎曲的圓柱形孢子鏈，另外在菌絲中有許多球形、籠狀的結(jié)構(gòu)。

a-菌株XY-R10在ISP-2平板的生長形態(tài)；b-體視鏡觀察菌株XY-R10 的菌落形態(tài)；c-油鏡觀察菌株XY-R10的氣生菌絲形態(tài)(1 000倍)圖1 菌株XY-R10的形態(tài)特征分析Fig.1 Analysis of morphological characteristics of the strain XY-R10

2.2 菌株XY-R10的系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株XY-R10進行16S rRNA測序，序列信息上傳至EzBioCloud網(wǎng)站比對，下載相似性較高的序列，用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建進化樹。結(jié)果顯示(圖2)，菌株XY-R10隸屬擬孢囊菌屬，與KibdelosporangiumphytohabitansKLBMP 1111T同源，相似度達99.79%。結(jié)合該菌的形態(tài)特征與文獻報道相比較，放線菌XY-R10為很可能與KibdelosporangiumphytohabitansKLBMP 1111T為同1個種，是1株稀有放線菌。

圖2 基于菌株XY-R10的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of the strain XY-R10

2.3 發(fā)酵粗提物抑菌活性的研究

菌株XY-R10發(fā)酵第6天的上清液對MRSA有較好的抑菌活性，如圖3-a所示，載樣量為10 μL上清液紙片的抑菌圈直徑(約17 mm)，略高于載藥量10 μg萬古霉素紙片的抑菌圈直徑(約15 mm)。考察了不同發(fā)酵時間發(fā)酵液的抑菌活性，抑菌活性物質(zhì)僅在發(fā)酵第6～8天出現(xiàn)(圖3-b)。

將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取制備粗提物，以多株臨床及食源性致病菌為指示菌，測定粗提物的抗菌譜。結(jié)果如表1所示，粗提物對MSSA、MRSA、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和無乳鏈球菌等革蘭氏陽性菌的MIC≤8 μg/mL，表現(xiàn)出較好的抑菌活性；對糞腸球菌和單增李斯特菌的MIC分別為128、256 μg/mL，抑菌活性微弱。粗提物對銅綠假單胞菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的MIC>512 μg/mL，無抑菌活性；對副溶血弧菌有微弱的抑菌作用(MIC=256 μg/mL)。因此，該粗提物對革蘭氏陽性菌有較廣譜的抑菌活性。

2.4 粗提物中抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

對粗提物抑菌活性成分的穩(wěn)定性考察結(jié)果見表2。室溫條件下，粗提物水溶液pH值調(diào)節(jié)為3、5、7時，抑菌圈大小與對照(未調(diào)節(jié)pH，原始pH值為6.6左右)基本一致，說明抑菌活性物質(zhì)在中性和弱酸性條件下較穩(wěn)定。當pH值提高至9和11時，抑菌圈變小，說明堿處理使抑菌活性物質(zhì)不穩(wěn)定因而活性降低。

a-發(fā)酵7 d的上清液對MRSA的抑菌活性；b-發(fā)酵上清液抑菌 活性隨發(fā)酵時間的變化圖3 發(fā)酵液上清抑菌活性的發(fā)現(xiàn)Fig.3 Antibacterial activity of fermentation broth注：萬古霉素10 μg，苯唑西林10 μg，發(fā)酵上清液10 μL

表1 發(fā)酵粗提物MIC的測定 單位：μg/mL

研究了酸堿和加熱同時處理對抑菌活性物質(zhì)的影響。粗提物水溶液在pH值為3時，經(jīng)60 ℃熱處理后抑菌圈略微減小，活性略微降低；而pH越高，熱處理后粗提物抑菌活性越差甚至失去活性。因此，粗提物中的抑菌活性物質(zhì)在弱酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較好，不耐受堿性環(huán)境，熱穩(wěn)定性較差。

表2 pH和溫度對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of pH and temperature on the stability of antibacterial active substances

2.5 粗提物分段分離后各部分的抑菌活性

使用C18柱對粗提物進行分段分離，并檢測各分離段的抑菌活性，結(jié)果如表3所示。用20%～60%甲醇洗脫的各分離段對MRSA具有不同程度抑菌活性，但它們的MIC值均高于粗提物、抑菌活性減弱，在MSSA、糞腸球菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、無乳鏈球菌中也有類似的結(jié)果。使用HPLC分析，各分離段的峰各不相同。推測粗提物中可能存在多個活性成分，粗提物廣譜抗革蘭氏陽性菌的作用可能為多個成分聯(lián)合的效果，因此經(jīng)分離后，各分離段的單獨作用的抑菌活性減弱。70%～100%甲醇洗脫的各分離段對所有菌株無抑菌活性(MIC>512 μg/mL)；各分離段對銅綠假單胞菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌均無抑菌活性(MIC>512 μg/mL)。

值得注意的是，與粗提物相比，40%甲醇洗脫的分離段對單增李斯特菌和副溶血弧菌的MIC值降低，抑菌活性有所增強，我們首先對這一分離段的成分進行研究。

表3 粗提物經(jīng)初步分離后各分離段MIC的測定 單位：μg/mL

2.6 LC-HRMS分析發(fā)酵粗提物成分

由圖4分析可知，粗提物中有超過9個較為明顯的組分，其中峰5～峰9來源于培養(yǎng)基。峰1和峰2的一級質(zhì)譜[M+H]+m/z分別為308.075 9和308.071 0，經(jīng)Mass Hunter定性分析軟件計算分子式均為C13H13N3O4S，二者有一些相同的二級質(zhì)譜碎片m/z290.05、m/z210.06、m/z181.06等，但紫外吸收峰略有不同，推測二者可能為同分異構(gòu)體。峰1為Maipomycin A，是本實驗室之前從菌株XY-R10篩選到的具有強效殺藻活性的化合物(圖4-h，原命名為Kibdelomycin A，后發(fā)現(xiàn)與已報道化合物重名，現(xiàn)改為Maipomycin A)[17-18]。結(jié)合HPLC-DAD檢測粗提物用40%甲醇分離的部分，該部分的主要成分是Maipomycin A，因此下一步對Maipomycin A的抑菌活性進行研究。

峰3在正離子模式下無質(zhì)譜響應，負離子模式的一級質(zhì)譜[M-H]-m/z為394.163 4，經(jīng)計算分子式為C23H25NO5。峰3紫外吸收峰在240、268、299、336 nm，與Azicemicin A(圖4-i，分子式C23H25NO9)有類似的紫外吸收(234、277、322、335 nm)[13]。Azicemicin A分離自擬孢囊菌屬的另一株菌Kibdelosporangiumsp.MJ126-NF4[19]，具有抗金黃色葡萄球菌活性(MIC ≥ 100 μg/mL)[13]，而峰3的分子式比Azicemicin A少4個氧原子，推測峰3可能為Azicemicins類化合物。

a-發(fā)酵粗提物HPLC圖；b-峰1紫外吸收圖；c-峰1一級質(zhì)譜圖；d-峰2紫外吸收圖；e-峰2一級質(zhì)譜圖；f-峰3紫外吸收圖； g-峰3一級質(zhì)譜圖；h-Maipomycin A結(jié)構(gòu)；i-Azicemicin A結(jié)構(gòu)圖4 LC-HRMS分析發(fā)酵粗提物成分Fig.4 LC-HRMS analysis the fermentation extracts

2.7 Maipomycin A抑菌活性的研究

Maipomycin A具有2,2′-聯(lián)吡啶的結(jié)構(gòu)，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌無抑菌活性，僅對表皮葡萄球菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌有抑菌作用，MIC分別為32、16、32 μg/mL(表4)。含有2,2′-聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物還有Caerulomycins[20]、Collismycins[21]和Pyrisulfoxins[22]等，這類化合物具有抗菌、細胞毒活性和免疫調(diào)節(jié)作用[23]，我們比較了Maipomycin A的3個結(jié)構(gòu)類似物(圖5)的抑菌活性。如表4所示，Collismycin A同樣對表皮葡萄球菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌有抑菌作用，活性與Maipomycin A相當，但Maipomycin B和Collismycin X的抑菌活性就相對較弱。從結(jié)構(gòu)上看，Maipomycin A和Maipomycin B僅在6位的基團有差異(圖5)，前者是醛肟基，而后者是醛基，Collismycin A和Collismycin X結(jié)構(gòu)上的差異也是如此。因此推測Maipomycin A和Collismycin A的抑菌活性很可能與6位的醛肟基有關(guān)，這與文獻報道的結(jié)論基本一致[25]。

表4 Maipomycin A及其類似物MIC的測定 單位：μg/mL

a-Collismycin A結(jié)構(gòu)；b-Maipomycin B結(jié)構(gòu)；c-Collismycin X結(jié)構(gòu)圖5 Maipomycin A類似物結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structures of Maipomycin A analogues

3 結(jié)論

紅樹林潮間帶是一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，孕育著豐富而新穎的微生物資源，是研究微生物天然產(chǎn)物的熱點之一[24]。本實驗室長期從事海洋和紅樹林來源微生物的分離及活性次級代謝產(chǎn)物的研究，菌株XY-R10即為紅樹林植物根際沉積物中分離得到的其中1株放線菌，本文對該菌進行了鑒定和抑菌活性的研究。經(jīng)菌落特征識別、顯微鏡觀察，測序比對和構(gòu)建進化樹分析，初步鑒定為擬孢囊菌屬的K.phytohabitans，是1株稀有放線菌。

放線菌XY-R10的發(fā)酵粗提物對多種常見的臨床和食源性致病菌有較好抑菌作用，具有廣譜的抗革蘭氏陽性菌活性。抑菌活性物質(zhì)在弱酸性條件下較穩(wěn)定，耐熱性差。粗提物經(jīng)分段分離后，各分離段的抑菌活性均減弱，推測粗提物中可能含有多個活性成分，其廣譜抗革蘭氏陽性菌的的作用可能為多個成分聯(lián)合的效果。利用LC-HRMS鑒定出粗提物中一個成分為Maipomycin A，此外還可能存在Maipomycin A和Azicemicin A的類似物。Maipomycin A對表皮葡萄球菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌有抑菌作用，其抑菌作用可能與6位的醛肟基相關(guān)，可為后續(xù)作用機制探索、構(gòu)效關(guān)系研究提供參考。

綜上，本文對紅樹林來源稀有放線菌XY-R10進行了分離和鑒定，并對其具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物進行了挖掘和初步研究，有望為臨床抗菌藥物的研發(fā)，以及食品工業(yè)進行抑菌防腐、生物防治提供一定的理論參考和實踐依據(jù)。