貴州草海濕地不同生境周叢生物碳、氮、磷生態(tài)化學計量學*

王天佑，夏品華，林 陶，杜 欣

(1：貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴陽 550001) (2：貴州師范大學高原濕地生態(tài)與環(huán)境研究中心，貴陽 550001)

周叢生物(periphyton)又名著生生物或者周叢藻類，主要由光自養(yǎng)微藻、細菌、真菌、原生動物、多細胞動物、有機或無機碎屑等組成[1-2]，是地表水生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分[3-5]. 周叢生物通過對初級生產(chǎn)和食物鏈的影響[6]，驅(qū)動著水體和沉積物中大多數(shù)元素的生物地球化學循環(huán)[7]. 例如，周叢生物在水體氮磷去除[8]、重金屬富集等方面發(fā)揮著重要作用[5,9]，逐漸被應用于水體凈化和水環(huán)境監(jiān)測[10]. 但是人類生產(chǎn)活動中營養(yǎng)物質(zhì)的過度排放，導致了全球31%的陸地集水區(qū)中周叢生物的大量生長，其中近四分之三(76%)是因磷富集所引起的[1]，對水生生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重的有害影響[11-13]. 因此，周叢生物已成為國內(nèi)外研究人員關注的一個熱點[4-5,14-15].

生態(tài)化學計量學(ecological stoichiometry)是以研究碳(C)、氮(N)、磷(P)為主的元素質(zhì)量平衡對生態(tài)交互作用影響的一種理論[16]，周叢生物化學計量比可反映水體中營養(yǎng)物質(zhì)的可用性[17]，對水體營養(yǎng)狀況具有重要的指示意義[18]. 近年來，國內(nèi)外學者通過研究周叢生物來指示河流[19]、湖泊[20]和濕地[21]等典型生態(tài)環(huán)境的變化特征. Godwin 等研究發(fā)現(xiàn)河流中周叢生物含有大量的N、P元素，在被沖刷到下游累積時，會對當?shù)厮鷳B(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生極大的威脅[22]. O’Brien 等根據(jù)周叢生物化學計量學提出用梯度法來揭示關于土地利用對河流功能影響的建議[17]. 的確，周叢生物元素組成會隨環(huán)境的改變而發(fā)生變化[23]，上下游生境的變化間接影響水體營養(yǎng)元素的縱向變化[22]，這將導致周叢生物計量比的變化. Schiller等研究發(fā)現(xiàn)西班牙東北部溪流中的周叢生物C∶N主要受光照和氮源的影響，其中森林地區(qū)最高，城市地區(qū)為中等，農(nóng)田地區(qū)最低[24]. 崔經(jīng)國等對北京密云水庫上下游河流中周叢生物化學計量研究發(fā)現(xiàn)，總磷(TP)是影響周叢生物生長的關鍵因素[18]. Drake等通過三維建模發(fā)現(xiàn)周叢生物C∶P和光照可以控制周叢生物在富營養(yǎng)河流中磷的固定和釋放[25]. 另外李九玉等指出周叢生物的生長凋落過程可調(diào)控水稻田中P元素的吸收和釋放[4]. Hillebrand等根據(jù)周叢生物化學計量比提出了營養(yǎng)限制閾值(C∶P>180且N∶P> 22，為P限制；C∶N>10且N∶P <13，為N限制[26]). 因此探究周叢生物生態(tài)化學計量學，對認識C、N、P元素在濕地生態(tài)系統(tǒng)中的循環(huán)和平衡機制具有參考價值. 化學計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)是指生物體在不斷變化的環(huán)境中維持自身元素含量和比率穩(wěn)定的能力[16,23]，能夠反映生物在面對復雜生存環(huán)境時的適應性[27]. 然而大多數(shù)研究主要關注水體營養(yǎng)與周叢生物化學元素之前循環(huán)的關系，對于周叢生物生長周期中內(nèi)穩(wěn)性變化特征的研究鮮有報道，水體總氮(TN)與TP是如何交互作用于周叢生物化學計量還不清楚. 因此明確周叢生物在不同生長階段C、N、P含量和化學計量比變化的穩(wěn)態(tài)性特征，以及水體TN與TP對于周叢生物化學計量的影響，將對于豐富水生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)化學計量學理論具有重要意義.

貴州草海濕地常年受到周邊人類生產(chǎn)生活排水的污染，近年來基于草海的研究主要集中于富營養(yǎng)化[28-30]和重金屬[9,31-32]等方面，對不同水位梯度下沉積物生態(tài)化學計量也有研究[33]，然而周叢生物在水生態(tài)系統(tǒng)中的元素循環(huán)特征尚不清楚. 因此，本研究通過周叢生物化學計量的研究，以期揭示：(1)生長周期和不同生境對周叢生物化學計量及其穩(wěn)態(tài)性特征的影響；(2)不同生境營養(yǎng)元素限制；(3)建立水體TP和TN及其交互作用與周叢生物化學計量的三維模型關系. 進而探究水體營養(yǎng)狀況與周叢生物化學計量之間的養(yǎng)分循環(huán)規(guī)律，為濕地生態(tài)系統(tǒng)的恢復和管理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)(26°47′35″～26°52′10″N，104°9′23″～104°20′10″E)位于貴州省威寧縣草海自然保護區(qū)，是天然喀斯特高原淡水湖泊濕地. 貴州草海屬于山地亞熱帶高原季風氣候，雨季為5-10月，年均降水量約為950.9 mm. 草海濕地是國家一級保護動物黑頸鶴(Grusnigricollis) 主要的越冬棲息地之一，但其生態(tài)系統(tǒng)受到人為活動的影響趨于退化[28-29]. 近幾年政府為加強對當?shù)丨h(huán)境的保護，在湖區(qū)周邊主要點源污染區(qū)修建了諸多污水處理廠和人工濕地. 其中，污水處理廠采用設備凈化和表層潛流植被凈化相結合的工程措施，人工濕地是以多個生態(tài)塘連接自然凈化為主. 本次采樣將以草海天然湖濱帶以及周邊受人類活動影響較大的農(nóng)田區(qū)、污水處理廠和人工濕地4種不同生境為研究對象.

1.2 樣品采集與處理

于2019年4月中旬，分別在貴州草海濕地湖濱帶、污水處理廠、農(nóng)田溝渠和人工濕地布設采樣點36個. 湖濱帶采樣點間隔3 km左右，共計15個；污水處理廠凈化池6個；農(nóng)田溝渠6個；人工濕地9個(圖1). 在水體表面0.1～0.3 m處開敞水域使用鑷子和尼龍刷采集周叢生物，每個樣點布設3處0.3 m×0.3 m樣方，收集3次重復并充分混合，根據(jù)周叢生物形態(tài)特征區(qū)分其生長周期(周叢生物大部由絲狀藻類組成，生長初期，色澤嫩綠至草綠，未構成完整的團聚體. 至衰老期，顏色深綠，結構復雜，為團聚體)，對于野外無法直接鑒定的周叢生物，后期通過光學顯微鏡鑒定分類. 共采集有效樣本36個，其中生長期周叢生物 16個，衰老期周叢生物 20個. 樣品用冰袋保存并及時送至-20℃冰箱保存待測，pH采用1∶2.5電位法，溶解氧(DO)濃度和水溫(T)采用便攜式儀器(HQ30d HACH)現(xiàn)場測定. 根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838-2002)水質(zhì)標準方法測定水體的理化性質(zhì)，包括總氮(TN)、總磷(TP)、氨氮(NH3-N)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)和葉綠素a(Chl.a). 參考《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[24]測定周叢生物指標，包括總有機碳(C)采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法，全氮(N)采用凱氏定氮法，全磷(P)采用SMT法.

圖1 采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling sites

1.3 統(tǒng)計分析

本研究中周叢生物C∶N、C∶P、N∶P均為質(zhì)量比，內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)(homeostasis index，H)根據(jù)方程式y(tǒng)=cx1/H計算[34]. 式中，y為周叢生物N、P含量或計量比，x為水體TN、TP含量或計量比，H為內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)，c為積分常數(shù). 參照Persson等的分類[34]，把H<1.33、1.334依次歸類為敏感態(tài)、弱敏感態(tài)、弱穩(wěn)態(tài)和穩(wěn)態(tài).

采樣圖采用ArcGIS 10.6繪制，實驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016進行整理. 水體營養(yǎng)指數(shù)參考卡爾森綜合營養(yǎng)指數(shù)法(TLI)，以CODMn、Chl.a、TN、TP濃度4個參數(shù)進行權重計算，使用ArcGIS克里金插值法分析采樣區(qū)水質(zhì)及周叢生物C、N、P含量的分布情況. 使用SPSS 22進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，根據(jù)單因素方差分析研究差異顯著性，根據(jù)雙因素方差分析比較生境和生長周期對周叢生物化學計量的影響差異. 使用R語言對周叢生物化學計量與水體理化指標做Pearson相關性分析，采用Mantel測試，探討不同生長周期周叢生物N、P、N∶P內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)和周叢生物化學計量與水體理化指標之間的關系. 最后通過Origin 2018軟件對周叢生物化學計量與水體理化指標(TN、TP濃度)進行非線性曲面擬合分析，進而根據(jù)三維模型分析TP、TN濃度及其交互作用對周叢生物化學計量的影響. 在分析前對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，使其符合正態(tài)分布.

2 結果與分析

2.1 水體理化指標

4個采樣區(qū)中水體平均溫度為15℃，pH值均值范圍為6.41～7.91，呈現(xiàn)中性. 其余物理化學性質(zhì)在4個生境間差異較大，且各區(qū)域內(nèi)部水質(zhì)變化也較大，尤其以NH3-N、Chl.a、TP、TN的變異系數(shù)最大(表1). 污水處理廠的TP((0.45±0.34)mg/L)和TN((6.52±3.43)mg/L)濃度最高，湖濱帶的TP((0.14±0.28)mg/L)和TN((1.23±0.64)mg/L)濃度最低.TLI從大到小依次為：污水處理廠(51.55±4.50)>農(nóng)田溝渠(50.41±4.50)>人工濕地(47.20±6.72)>湖濱帶(41.86±6.91)，大體呈現(xiàn)由上游到下游水質(zhì)變好的趨勢(圖2).

表1 采樣點水體理化指標*

圖2 水體營養(yǎng)指數(shù)(TLI)和周叢生物C、N、P含量熱圖Fig.2 Heat map of water column trophic level index (TLI) and C, N, P content of periphyton

2.2 周叢生物元素及化學計量比

草海濕地周叢生物 C、N、P含量分別在119.58～230.86、12.96～32.07、1.11～5.90 g/kg之間，C∶N、N∶P、C∶P 分別在3.93～16.03、2.99～15.92、24.99～181.66之間(圖3). 周叢生物C、N、P含量大體呈現(xiàn)從上游到下游遞減的趨勢(圖2). C、P含量在污水處理廠最高，N含量在農(nóng)田溝渠最高. C、N含量在人工濕地最低，P含量在湖濱帶最低. C∶N、N∶P、C∶P均在湖濱帶最高，N∶P和C∶P在污水處理廠最低，C∶N在農(nóng)田溝渠最低(圖3).

在不同生境間，周叢生物元素含量和化學計量比差異顯著(圖2,P<0.05). 隨著水體營養(yǎng)濃度的上升，周叢生物大致呈現(xiàn)出C、N、P含量升高、計量比下降的趨勢. 僅人工濕地衰老期的周叢生物C含量顯著低于其他區(qū)域；污水處理廠和農(nóng)田溝渠的周聰生物N含量顯著高于湖濱帶和人工濕地；P元素波動最大，其中，生長期周叢生物P含量在污水處理廠高于湖濱帶和人工濕地，衰老期周叢生物P含量在污水處理廠和農(nóng)田溝渠顯著高于湖濱帶和人工濕地. 周叢生物C∶P和C∶N隨著營養(yǎng)水平的升高反而降低，而N∶P無顯著變化. 污水處理廠和農(nóng)田溝渠的周叢生物C∶N顯著低于湖濱帶和人工濕地，湖濱帶周叢生物C∶P顯著高于其他3個區(qū)域，周叢生物N∶P在人工濕地和污水處理廠顯著低于湖濱帶和農(nóng)田溝渠. 在相同生境中，不同生長周期的周叢生物C含量具有顯著差異性(圖2a,P<0.05)，生長期周叢生物的C、N、P含量除在農(nóng)田溝渠外均低于衰老期周叢生物，化學計量均無顯著差異.

圖3 周叢生物C、N、P含量及化學計量比(圖中不同小寫字母表示在同一生境中不同生長周期之間具有 顯著差異性(P<0.05)，不同大寫字母表示不同生境間具有顯著差異性(P<0.05))Fig.3 C, N and P contents and stoichiometric ratio in periphyton (a, b, c represent significant differences in the same habitat(P<0.05), and A, B, C represent significant differences between different habitats(P<0.05))

生境對周叢生物元素含量和化學計量比均有極顯著的影響(P<0.01)，而生長周期僅對C、P含量和N∶P 有極顯著影響(P<0.01). 其中生境對N含量和C∶N、C∶P的影響大于生長周期，其余則相反，兩者交互作用只對N∶P有極顯著的影響(P<0.01)(表2).

表2 雙因素方差分析檢驗生境、生長周期及兩者交互作用對周叢生物化學計量的影響

2.3 周叢生物內(nèi)穩(wěn)態(tài)分析

從表3可以看出，周叢生物N、P、N∶P的內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)均大于1，生長期周叢生物N、P元素屬于弱穩(wěn)態(tài)類型(HP>2;HN<4)，衰老期周叢生物N、P元素屬于穩(wěn)態(tài)類型(HP、HN>4)，N∶P計量比均為穩(wěn)態(tài)類型(HN∶P>4). 說明衰老期周叢生物N、P元素的內(nèi)穩(wěn)性高于生長期周叢生物，而不同生長周期對于N∶P內(nèi)穩(wěn)性的影響較小. 通過Mantel測試發(fā)現(xiàn)(圖4)，N∶P、TN∶TP、TN濃度、TP濃度、TLI指數(shù)與周叢生物內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)之間存在極顯著正相關 (Mantel’sR>0.5,P<0.01)，與衰老期周叢生物的相關性強于生長期周叢生物. 另外，C∶N、C∶P、N含量、P含量僅與生長期周叢生物呈顯著正相關(Mantel’sR>=0.2, 0.01

表3 周叢生物不同生長周期化學計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)*

2.4 水體理化指標與周叢生物化學計量的關系

水體理化指標和周叢生物化學計量關系的分析結果(圖4)顯示，水體TLI指數(shù)、TP濃度、TN濃度與周叢生物N、P含量及化學計量比均有顯著相關關系(P<0.05)，TLI指數(shù)與N∶P除外(P>0.05)，其中與N含量、P含量為正相關關系，與C∶N、N∶P、C∶P為負相關關系. TN∶TP與N∶P呈顯著正相關(P<0.05). 說明水體理化指標中，TN和TP濃度可能是影響周叢生物元素含量化學計量比變化的主要因素. 另外，周叢生物C、N、P元素含量之間均為極顯著正相關關系(P<0.01)，化學計量比之間僅N∶P和C∶N無顯著相關性(P>0.05). 周叢生物N、P含量與化學計量比呈顯著正相關關系(P<0.05)，N含量與N∶P除外(P>0.05)，而C含量與化學計量比之間均無顯著相關性(P>0.05). 表明周叢生物元素中，N、P含量是影響其化學計量比變化的主要元素.

圖4 水體理化指標、周叢生物化學計量與周叢生物生長期和衰老期內(nèi)穩(wěn)態(tài)指數(shù)(HN∶P、HP和 HN) 的相關性(*代表 P <0.05，顯著相關； **代表 P<0.01，***代表P<0.001，極顯著相關)Fig.4 Correlation of water column physicochemical index, periphyton stoichiometry and homeostasis index (HN∶P, HP and HN) in periphyton growth period and decline period (Asterisks indicate significant correlations，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

2.5 水體TN、TP濃度與周叢生物化學計量的關系

對周叢生物的化學計量比與水體TN、TP濃度進行非線性曲面擬合(表4, 圖5)，采用最優(yōu)方程. 當水體TP濃度升高時，C∶P、N∶P、C∶N均隨之降低，而當TN濃度升高時，只有C∶N和C∶P降低. N∶P主要受TP濃度變化的影響(P=0.004)，C∶N則主要受控于TN濃度(P=0.01)，TN和TP濃度對C∶P的影響同等重要(P=0.004).

3 討論

3.1 周叢生物化學計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)特征

探究物種在變化的環(huán)境中保持元素動態(tài)平衡的能力是生態(tài)化學計量學的核心問題[35]，主要是C、N、P[36]. 本研究發(fā)現(xiàn)，處于同一環(huán)境中的衰老期周叢生物元素含量均大于生長期周叢生物. 這是由于周叢生物的C含量主要源于藻類和細菌[37-39]，而大量吸收和同化會導致C的積累[40]，N元素主要來自藻類的同化作用[41]，P元素以吸收和吸附為主[8]. 盡管衰老期周叢生物生長速率小于生長期周叢生物，但衰老期周叢生物生物量大、生長時間久，所以在相同環(huán)境中比生長期周叢生物的元素含量更高.

化學計量學內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制認為生物能夠在生態(tài)系統(tǒng)中保持自身元素組成的相對穩(wěn)定[42]. Sterner等認為以自養(yǎng)藻類為主要成分的周叢生物，其化學計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)較弱[23]，但也有研究學者發(fā)現(xiàn)周叢生物具有一定程度的內(nèi)穩(wěn)性特征[43]. 本研究發(fā)現(xiàn)在4個不同的生境間，隨著水體營養(yǎng)鹽濃度的上升，周叢生物N、P元素含量也升高，而C元素含量無顯著變化. 崔經(jīng)國等的研究認為周叢生物C元素含量主要來自溶解于水體中的CO2，與水體中的有機質(zhì)關聯(lián)小[18]，本文也發(fā)現(xiàn)周叢生物C含量與CODMn、TN、TP濃度等均無顯著相關性. 基于此，本研究僅對N、P元素及N∶P的內(nèi)穩(wěn)性進行分析，發(fā)現(xiàn)周叢生物的N∶P保持良好的穩(wěn)態(tài)型，而N、P元素在衰老期為穩(wěn)態(tài)型，在生長期為弱穩(wěn)態(tài)型. 表明周叢生物的N、P含量及其N∶P在草海不同生境中基本符合化學計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制. Persson等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的程度與生物體內(nèi)部(如生長狀態(tài))因素有一定關系，即藻類的穩(wěn)態(tài)會隨生長速率的增加而增強[34]，說明不同生長周期會對周叢生物化學計量的穩(wěn)態(tài)性造成影響. 本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，C∶N、C∶P和N、P含量僅與生長期周叢生物呈顯著正相關(Mantel’sR≥0.2, 0.01

表4 周叢生物計量比與水體TN、TP濃度的非線性曲面擬合

圖5 周叢生物化學計量比對水體TN、TP濃度響應的三維模型Fig.5 A three-dimensional model of the response of periphyton stoichiometry ratio to TN and TP concentrations in water column

3.2 周叢生物元素組成與水體營養(yǎng)水平之間的關系

淡水周叢生物C∶N∶P的最佳化學計量比為119∶17∶1[43]，與海洋周叢生物106∶16∶1非常接近[44]. O’Brien 等研究發(fā)現(xiàn)周叢生物C∶N波動范圍較大，在4.4～12.5之間(均值7.6)[17]. Hillebrand等提出C∶N處于5～10之間最適合藻類生長[43]，后來又指出當C∶P>180且N∶P> 22時，為P限制;當C∶N>10且N∶P <13時，為N限制[26]. 本研究(進行了質(zhì)量比和摩爾比之間的轉(zhuǎn)換)發(fā)現(xiàn)4個生境都不存在N限制，而只有湖濱帶處于P限制，其原因可能是其他3個區(qū)域都接受了不同程度的外源污染，包括農(nóng)作物肥料污染[45]、生活污水的排放等，導致N、P污染嚴重. 而湖濱帶受到人類活動影響最小，水體受污染程度也最低. 綜上，污水處理廠、農(nóng)田溝渠和人工濕地養(yǎng)分充足，N和P混合污染的風險較大.

化學計量特征是物種在生長過程中對其周邊環(huán)境長期適應的結果，周叢生物的計量比可能由于生境的不同引起較大的變化[43,46]. 本研究雙因素方差分析(表2)也表明生境對周叢生物的元素含量和化學計量比均呈顯著影響(P<0.05)，大于生長周期所產(chǎn)生的影響. 崔經(jīng)國等研究發(fā)現(xiàn)潮白河周叢生物元素含量和水體營養(yǎng)水平呈顯著相關[18]，高學平等進一步研究發(fā)現(xiàn)水體TN、TP濃度與周叢生物化學計量比之間通常是密切相關、相互耦合的[47]，本研究結果與其一致. 相關分析表明，水體TLI指數(shù)、TP和TN濃度與周叢生物元素N、P含量及化學計量比呈顯著的相關性(P<0.05，圖4). 綜上，水體營養(yǎng)狀態(tài)的變化直接影響周叢生物化學計量的動態(tài)變化，其中主要因子是TP和TN濃度. 另外，有學者提出應該通過水體營養(yǎng)濃度和化學計量比之間的關系創(chuàng)建一個更清晰的周叢生物化學計量學模式[17,48]. 本研究表明，基于水體TP、TN濃度和周叢生物化學計量比的三維模型(圖5)，可評估水體營養(yǎng)水平和周叢生物化學計量之間的關系. 但是Stelzer等認為僅靠水體和周叢生物的養(yǎng)分比率來預測養(yǎng)分限制的方法可能會有局限性[48]. 因此，該模型還需在以后的研究中進一步深化.

周叢生物是草海濕地的主要初級生產(chǎn)力之一，其元素變化將通過食物鏈導致高級種群化學計量的變化. 因此合理控制水體TN、TP濃度對于維護草海生態(tài)系統(tǒng)的平衡至關重要. 但是目前還缺乏高一級生物群落的化學計量知識，有待進一步研究.

4 結論

1)周叢生物的N∶P計量比為穩(wěn)態(tài)型，而N、P元素在衰老期為穩(wěn)態(tài)型，在生長期為弱穩(wěn)態(tài)型.

2) 草海湖濱帶處于P限制狀態(tài)，人工濕地、污水處理廠和農(nóng)田溝渠養(yǎng)分充足，元素含量呈現(xiàn)從上游到下游遞減的趨勢. 水體營養(yǎng)狀態(tài)是影響周叢生物元素組成動態(tài)變化的主要因素，其中主要因子是水體TP和TN濃度.

3)周叢生物N∶P主要受水體TP濃度的影響，C∶N則主要受水體TN濃度的影響，而水體TN和TP濃度對C∶P的影響同等重要. 研究表明基于水體TN、TP濃度和周叢生物化學計量的三維模型可用來評估不同水體中營養(yǎng)元素限制.