高氏盆炎方五號(hào)方對(duì)慢性盆腔炎大鼠抗炎、抗粘連的作用及機(jī)制研究※

王楚然 高 慧 徐文君 郝艷紅 陳十昔

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院2017級(jí)碩士研究生，河北 唐山 063000)

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)近年來(lái)被稱為盆腔炎性疾病后遺癥(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)，即急性盆腔炎失治、誤治，或患者身體狀況不佳、免疫系統(tǒng)較弱導(dǎo)致病程延長(zhǎng)，但也有部分患者起病緩慢，無(wú)急性病史[1]。CPID主要臨床表現(xiàn)為下腹部疼痛，伴有肛門(mén)和腰腹墜脹疼痛，白帶增多、質(zhì)稠、異味等，屬中醫(yī)學(xué)婦人腹痛、癥瘕、帶下病、不孕等范疇。近年來(lái)CPID發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，其病因復(fù)雜，病情纏綿，治療棘手[2-3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是抗炎治療，抗生素有一定作用，但患者易產(chǎn)生耐藥性且常有副作用[4]。中醫(yī)治療CPID具有療效明顯、無(wú)副作用、無(wú)耐藥性、給藥方法多樣等優(yōu)勢(shì)[5]，在抗炎、殺菌、調(diào)節(jié)免疫及鎮(zhèn)痛等方面療效確切[6]。高氏盆炎方系列方由高慧教授總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立，各號(hào)方針對(duì)CPID不同證型，其中五號(hào)方具有活血化瘀、溫經(jīng)散寒、破瘀消癥功效，臨床主要用于治療寒凝血瘀型CPID。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察高氏盆炎方五號(hào)方對(duì)CPID大鼠抗炎、抗粘連的作用機(jī)制，為其臨床治療CPID提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雌性SD大鼠75只，12周齡，體質(zhì)量200～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1003。飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，室溫23～25 ℃，勤通風(fēng)，光照條件良好，自由攝食、飲水，墊料每3 d更換1次。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 高氏盆炎方五號(hào)方藥物組成：丹參15 g，小茴香6 g，沒(méi)藥10 g，炮姜4 g，肉桂10 g，赤芍15 g，延胡索15 g，當(dāng)歸10 g，桃仁10 g，三棱10 g，蒲黃10 g，莪術(shù)10 g，五靈脂10 g。以上中藥購(gòu)自河北省石家莊市中醫(yī)院中藥房，由河北省石家莊市中醫(yī)院制劑室將其煎熬濃縮成生藥濃度為2.8 g/mL的中藥溶液，保存在4 ℃冰箱中備用。少腹逐瘀顆粒(吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000041)，用蒸餾水配制成0.2 g/mL溶液，保存在4 ℃冰箱中備用；人胎盤(pán)組織液(湖南一格制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字S43020001)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液(PBS)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；苯酚凝膠(河北中醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室)；4%多聚甲醛固定液(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(內(nèi)含蘇木素染液、分化液、伊紅染液)(北京索萊寶科技有限公司)；人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素2(IL-2)ELISA檢測(cè)試劑盒(南京嘉譽(yù)達(dá)生物科技有限公司)；FGF-2免疫組化試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；一抗工作液、二抗工作液(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；總RNA試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)；熒光定量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；數(shù)碼顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)；酶標(biāo)儀(MK3型，芬蘭雷勃集團(tuán)中國(guó)區(qū)總部)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組 75只SD雄性大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境后，于第8 d清晨禁食，隨機(jī)抽取10只為空白組，其余65只造模。使用2%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠仰臥位固定，剪去手術(shù)區(qū)被毛，碘伏消毒，于大鼠下腹正中做切口，長(zhǎng)約1 cm，從膀胱后找到子宮，暴露并固定，首先用注射器針頭機(jī)械損傷大鼠左側(cè)子宮內(nèi)膜組織，再用1 mL注射器從子宮分叉處進(jìn)針，向左側(cè)子宮內(nèi)注入苯酚凝膠配制的25%苯酚膠漿0.06 mL，之后立即夾閉針孔，同時(shí)墊高大鼠臀部偏向于右側(cè)，防止苯酚膠漿流出，最后將子宮納入腹腔，逐層縫合切口，碘酊消毒術(shù)區(qū)皮膚，傷口使用敷料覆蓋包扎。造模后第10 d，隨機(jī)抽取5只大鼠，開(kāi)腹取子宮組織，光鏡下見(jiàn)子宮壁增厚，正常組織被破壞，慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，表明CPID大鼠模型建立成功。將余下60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即模型組、少腹逐瘀顆粒組、人胎盤(pán)組織液組及高氏盆炎方五號(hào)方高、中、低劑量組，每組10只。

1.2.2 給藥方法 空白組自由食水；模型組予0.9%氯化鈉注射液1 mL/100 g灌胃；高氏盆炎方五號(hào)方高中、低、劑量組分別予高氏盆炎方五號(hào)方28、14、7 g/kg灌胃；少腹逐瘀顆粒組予少腹逐瘀顆粒1.5 g/kg灌胃；人胎盤(pán)組織液組予人胎盤(pán)組織液1 mL/kg后腿大腿肌肉處注射。均每日1次，連續(xù)20 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 血清FGF-2、IL-2含量 于給藥后第21 d清晨禁食，末次給藥24 h后，予2%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后固定，采集腹主動(dòng)脈血，靜置，離心，取上清，分裝低溫保存?zhèn)溆茫珽LASA法測(cè)定血清FGF-2、IL-2含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2 子宮組織病理形態(tài)學(xué) 取大鼠子宮組織，分離多余脂肪，使用4%多聚甲醛固定液固定。脫水處理后，二甲苯透明，2次浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，將每個(gè)子宮組織切成石蠟切片，然后做烘干處理，經(jīng)HE染色，樹(shù)脂封片，數(shù)碼顯微鏡下(×200倍)觀察子宮組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 FGF-2蛋白表達(dá)水平 大鼠子宮組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化；恒溫培育；熱修復(fù)抗原90 s，PBS沖洗，每次3 min，重復(fù)3次；置于3%過(guò)氧化氫(H2O2)，37 ℃孵育10～15 min，PBS沖洗，每次3 min，重復(fù)3次；非免疫血清封閉40 min；滴加適當(dāng)比例稀釋過(guò)的一抗工作液過(guò)夜，PBS沖洗，每次3 min，重復(fù)3次；滴加二抗工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，每次3 min，重復(fù)3次；滴加PBS，37 ℃孵育10～15 min，PBS沖洗，每次3 min，重復(fù)3次；用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后常規(guī)脫水；透明；中性樹(shù)膠封片。圖像采集時(shí)，在特定的放大倍數(shù)下，盡量選擇相同部位視野。鏡下可見(jiàn)子宮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒時(shí)為陽(yáng)性表達(dá)。用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)細(xì)胞測(cè)量程序計(jì)算單位面積陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值(AOD)，AOD越大陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)越強(qiáng)。

1.3.4 FGF-2 mRNA表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法測(cè)定FGF-2 mRNA表達(dá)水平。取出凍存的子宮組織，粉碎、搖勻，取細(xì)胞懸液加入總RNA提取試劑1 mL常規(guī)方法提取總RNA，取5 μL RNA樣品測(cè)定濃度后，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系20 μL(包括cDNA模板1 μL，2×PCR PreMix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，50×TOX ReferenceDye 0.4 μL，去核糖核酸酶(RNase)的水6.6 μL)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性95 ℃ 10 min，然后(95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s)×40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)cDNA擴(kuò)增，獲得qRT-PCR反應(yīng)曲線，F(xiàn)GF-2基因Ct值-GAPDH基因Ct值=ΔCt，計(jì)算每個(gè)目的基因的Q值及Q均值(按照公式Q=2-ΔCt)，最后求出RQ值(RQ=Q值/Q均值)，將RQ值統(tǒng)計(jì)分析。擴(kuò)增的目的基因引物序列和片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增的目的基因引物序列和片段長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡下空白組大鼠子宮各層界限清楚，腺體規(guī)整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠宮腔擴(kuò)張?zhí)幾訉m壁變薄，增生明顯處子宮壁增厚，腺體被破壞，有內(nèi)膜上皮脫失現(xiàn)象，部分成纖維細(xì)胞增生，全層皆可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。高氏盆炎方五號(hào)方高劑量組大鼠宮腔擴(kuò)張程度明顯輕于模型組，上皮細(xì)胞形態(tài)趨于正常，內(nèi)膜基本無(wú)充血水腫，炎癥細(xì)胞明顯減少。高氏盆炎方五號(hào)方中劑量組大鼠宮腔擴(kuò)張程度明顯輕于模型組，子宮腔壁結(jié)構(gòu)正?；蛏栽龊瘢蟛糠窒袤w恢復(fù)正常，稍有內(nèi)膜充血、水腫，成纖維細(xì)胞增生不明顯，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組大鼠宮腔擴(kuò)張程度輕于模型組，肌層結(jié)構(gòu)較紊亂，部分內(nèi)膜充血、水腫，上皮細(xì)胞形態(tài)可見(jiàn)增生樣變，較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。少腹逐瘀顆粒組大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)變化與高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組相似。人胎盤(pán)組織液組大鼠宮腔擴(kuò)張程度明顯輕于模型組，子宮組織結(jié)構(gòu)稍清晰，上皮細(xì)胞增生現(xiàn)象減少，間質(zhì)細(xì)胞輕度水腫，腺體較完整，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)(HE，×200)

2.2 各組大鼠血清FGF-2、IL-2含量比較 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，模型組FGF-2含量高于空白組(P<0.05)，IL-2含量低于空白組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中、低劑量組及少腹逐瘀顆粒組、人胎盤(pán)組織液組FGF-2含量均低于模型組(P<0.05)，IL-2含量均高于模型組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組FGF-2含量均低于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)，IL-2含量均高于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組、少腹逐瘀顆粒組FGF-2含量均高于人胎盤(pán)組織液組(P<0.05)，IL-2含量低于人胎盤(pán)組織液組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組FGF-2含量均低于高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組(P<0.05)，IL-2含量均高于高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組(P<0.05)；空白組、高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組及人胎盤(pán)組織液組FGF-2、IL-2含量?jī)蓛杀容^差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清FGF-2、IL-2含量比較

2.3 各組大鼠子宮組織FGF-2蛋白表達(dá)的AOD比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠子宮組織FGF-2蛋白表達(dá)的AOD比較

由表3可見(jiàn)，模型組FGF-2蛋白表達(dá)的AOD高于空白組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中、低劑量組及少腹逐瘀顆粒組、人胎盤(pán)組織液組FGF-2蛋白表達(dá)的AOD均低于模型組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組FGF-2蛋白表達(dá)的AOD均低于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組、少腹逐瘀顆粒組FGF-2蛋白表達(dá)的AOD均高于人胎盤(pán)組織液組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組FGF-2蛋白表達(dá)的AOD均低于高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組(P<0.05)；空白組、高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組及人胎盤(pán)組織液組FGF-2蛋白表達(dá)的AOD兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠子宮組織FGF-2蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

2.4 各組大鼠子宮組織FGF-2 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，模型組FGF-2 mRNA表達(dá)水平高于空白組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中、低劑量組及少腹逐瘀顆粒組、人胎盤(pán)組織液組FGF-2 mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組FGF-2 mRNA表達(dá)水平均低于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組、少腹逐瘀顆粒組FGF-2 mRNA表達(dá)水平均高于人胎盤(pán)組織液組(P<0.05)；高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組FGF-2 mRNA表達(dá)水平均低于高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組(P<0.05)；空白組、高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組及人胎盤(pán)組織液組FGF-2 mRNA表達(dá)水平兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠子宮組織FGF-2 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

CPID是婦科常見(jiàn)病和多發(fā)病，也是引起盆腔粘連的最常見(jiàn)原因之一[7]，其反復(fù)發(fā)作、經(jīng)久不愈的特點(diǎn)嚴(yán)重影響婦女身心健康，增加家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)[8]。CPID臨床癥狀多以下腹刺痛或墜痛為主，經(jīng)期、性生活后及勞累后加重，月經(jīng)色黯有塊，舌質(zhì)黯有瘀斑，脈澀等血瘀證癥狀。高教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，血瘀是CPID的核心病機(jī)，寒凝血瘀證是常見(jiàn)證型。高氏盆炎方五號(hào)方將少腹逐瘀湯、宮外孕Ⅱ號(hào)方(丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù))兩方化裁合用，在溫陽(yáng)化瘀基礎(chǔ)上增強(qiáng)破瘀消癥作用，形成以活血化瘀消癥為主，兼溫經(jīng)止痛的治療大法。方中赤芍、蒲黃、五靈脂、丹參、桃仁、三棱、莪術(shù)、沒(méi)藥活血祛瘀消癥為主，小茴香、炮姜、延胡索、當(dāng)歸、肉桂溫經(jīng)理氣止痛為主，諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，行氣破血，調(diào)達(dá)氣機(jī)，消癥散結(jié)，活血化瘀，消腫止痛，溫經(jīng)散寒，扶正祛邪，為婦科治療CPID的有效方劑?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，具有活血化瘀作用的藥物能改善微循環(huán)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫作用，使纖維蛋白溶解酶活性增強(qiáng)，粘連松解，從而達(dá)到治療CPID目的[9-10]。

高教授提出盆腔炎有濕性炎癥和干性炎癥不同，急性盆腔炎多是以滲出為主的“濕性炎癥”，CPID多是以增生、粘連為主的“干性炎癥”，故CPID所致盆腔粘連是亟待解決的問(wèn)題。FGF-2過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)炎癥組織中成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖與分化，合成大量膠原纖維，是與CPID密切相關(guān)的粘連相關(guān)細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，CPID模型大鼠子宮組織中若發(fā)生炎癥和粘連可表現(xiàn)為FGF-2表達(dá)增高[11]。FGF-2也是加快血管生成的因子，修復(fù)血管同時(shí)會(huì)使子宮組織的纖維化與粘連更加嚴(yán)重，同時(shí)它也發(fā)揮了促炎作用，誘導(dǎo)炎癥因子和自由基產(chǎn)生，加重炎性反應(yīng)[11-12]。IL-2參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是機(jī)體重要的抗炎生化標(biāo)志物，激發(fā)免疫效應(yīng)器細(xì)胞，參與抗體反應(yīng)，起到明顯的抗炎作用，還可調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)人體自身的抗感染能力[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清FGF-2水平和子宮組織FGF-2蛋白及FGF-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，血清IL-2水平明顯降低，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示FGF-2過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)炎癥組織中成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖與分化，抗炎因子IL-2表達(dá)被抑制，加重炎性反應(yīng)。經(jīng)治療，高氏盆炎方五號(hào)方高、中、低劑量組血清FGF-2水平和子宮組織FGF-2蛋白及FGF-2 mRNA表達(dá)水平降低，血清IL-2水平升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組與空白組、人胎盤(pán)組織液組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明高氏盆炎方五號(hào)方可有效降低FGF-2在CPID大鼠血清和子宮組織中水平，升高血清中IL-2含量，從而減輕大鼠子宮組織的纖維化和瘢痕，防止和減少粘連，提高自身抗炎能力，并可減輕慢性炎癥的嚴(yán)重程度。其中高氏盆炎方五號(hào)方高、中劑量組等效，治療效果最突出，高氏盆炎方五號(hào)方低劑量組療效次之，可能是劑量不足所致。

綜上所述，高氏盆炎方五號(hào)方對(duì)CPID大鼠可起到抑制炎癥發(fā)展、促進(jìn)炎癥吸收及抗組織粘連作用，其機(jī)制可能與下調(diào)FGF-2水平、上調(diào)IL-2水平有關(guān)。