非壓迫性椎間盤髓核突出所致神經(jīng)根損傷大鼠血清白細(xì)胞介素23、白細(xì)胞介素17的表達(dá)水平及意義

李 堅(jiān) 梁 茉 郭焱雄 胡軍祖

(1 湖南省郴州市第一人民醫(yī)院南院急診科，郴州市 423000，電子郵箱：11830027@qq.com；2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，廣西桂林市 541000)

根性神經(jīng)痛是指脊神經(jīng)根受到各種有害性刺激而引起的疼痛，是腰椎間盤突出癥中最常見(jiàn)的癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。根性神經(jīng)痛發(fā)病率較高，其發(fā)病機(jī)制與治療仍存在很大的爭(zhēng)論。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為機(jī)械性壓迫是導(dǎo)致神經(jīng)根疼痛的最主要因素，但近年來(lái)有研究表明自身免疫反應(yīng)和相關(guān)炎癥介質(zhì)是導(dǎo)致神經(jīng)根疼痛的關(guān)鍵因素[2-3]，但其引起的神經(jīng)根損傷的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。本研究通過(guò)檢測(cè)非壓迫性椎間盤髓核突出導(dǎo)致神經(jīng)根損傷大鼠血清中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17、IL-23的表達(dá)水平，探討IL-23/IL-17炎癥軸在神經(jīng)損傷中的作用，為根性神經(jīng)痛的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 雄性SD大鼠48只購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物合格證號(hào)： SCXK (桂)2013-0001]，10月齡，體重在300～350 g之間，并飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)環(huán)境中，同組每2只大鼠飼養(yǎng)于一個(gè)鋼絲籠中，室溫度為 22℃～26℃，每日早晨8:00至晚20:00開(kāi)燈，晚20:00至次日8:00熄燈，給予充足的食物和水。大鼠IL-17 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、IL-23 ELISA試劑盒均購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司(批號(hào)：A1324、A1316)。

1.2 模型建立、分組與處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組24只。參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行動(dòng)物造模：采用7%水合氯醛(1.5 mL/只)腹腔內(nèi)注射后將大鼠固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)備皮、消毒;以L4～5椎間隙為中心，做約長(zhǎng)2 cm的后正中切口，顯露L4～5關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)及橫突，小型咬骨鉗咬除L4～5右側(cè)關(guān)節(jié)突及椎板，顯露L4～5神經(jīng)根；消毒實(shí)驗(yàn)組大鼠尾，距根部1 cm處切斷，切開(kāi)尾椎間盤，取4～5個(gè)椎間盤髓核組織，放置在L4～5神經(jīng)根周圍，但不壓迫神經(jīng)根，消毒后縫合，制作成非壓迫性椎間盤髓核突出的動(dòng)物模型。對(duì)照組采用同樣的手術(shù)方法造模，但神經(jīng)根旁不放置髓核組織。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 分別于術(shù)后1周、3周、5周，每組采用隨機(jī)數(shù)字表法選取8只大鼠，檢測(cè)大鼠的右后肢疼痛縮爪閾值及血清IL-17、IL-23水平，并觀察大鼠腰椎神經(jīng)根形態(tài)學(xué)變化。(1)參考文獻(xiàn)[4]中的方法檢測(cè)大鼠右后肢疼痛縮爪閾值：將大鼠右后肢外露并固定，待大鼠安靜后，用自制的痛閾測(cè)量器檢測(cè)大鼠右后肢縮爪閾值。測(cè)量器由1個(gè)5 mL注射器和水銀血壓計(jì)改裝而成，將注射器的內(nèi)芯做成活塞，20 mL注射器的針尖磨鈍并粘在活塞上，注射器與血壓計(jì)用硅膠管相連。將磨鈍的注射器針頭置于大鼠右后爪的第2～3跖骨之間，捏皮囊給血壓計(jì)充氣，將大鼠出現(xiàn)尖叫或縮爪時(shí)的血壓計(jì)讀數(shù)作為疼痛縮爪閾值，間隔至少20 min后再次測(cè)量1次，取平均值。(2)檢測(cè)血清IL-17、IL-23水平：抽取大鼠腹腔靜脈血2 mL，置于血清分離管中在室溫放置2 h，然后室溫下以2 000 r/min離心20 min，取上清并置于-20℃保存；采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-23、IL-17的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。(3)觀察大鼠腰椎神經(jīng)根形態(tài)學(xué)變化：將大鼠脫臼處死后顯露其腰神經(jīng)根，切取1 cm L4～5神經(jīng)根標(biāo)本，然后浸泡在福爾馬林液中固定1周；然后將神經(jīng)根包埋在石蠟中進(jìn)行切片，厚度為10 μm；將切片脫蠟并進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色；常規(guī)脫水、透明、樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察大鼠腰椎神經(jīng)根形態(tài)學(xué)變化并照相保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后逐漸出現(xiàn)易激惹、多動(dòng)等現(xiàn)象，術(shù)后3周時(shí)最為明顯，術(shù)后5周時(shí)恢復(fù)正常；而對(duì)照組大鼠術(shù)后未出現(xiàn)易激惹、多動(dòng)等現(xiàn)象。術(shù)后1周、3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠右后肢疼痛縮爪閾值均低于對(duì)照組，血清IL-23與IL-17水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)；而術(shù)后5周時(shí)，兩組大鼠的右后肢縮爪閾值及血清IL-23、IL-17水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1～3。

表1 兩組大鼠右后肢疼痛縮爪閾值的比較(x±s，mmHg)

表2 兩組大鼠血清IL-17及IL-23水平的比較(x±s，pg/mL)

HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠術(shù)后神經(jīng)纖維排列規(guī)律，大小基本一致，髓鞘完整，呈紅色，位于軸突周圍，未發(fā)現(xiàn)變性改變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后1周時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)根縱切面可見(jiàn)神經(jīng)纖維髓鞘部分崩解并呈空泡病變，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；術(shù)后3周時(shí)其神經(jīng)根損傷加重，神經(jīng)纖維排列不規(guī)律，大小不一，髓鞘崩解，空泡樣病變嚴(yán)重；術(shù)后5周時(shí)其神經(jīng)根基本恢復(fù)正常。見(jiàn)圖1。

圖1 造模后兩組大鼠腰椎神經(jīng)根形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)注：圖A～C分別為對(duì)照組術(shù)后1周、3周、5周神經(jīng)根縱切面，圖D～F分別為實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周、3周、5周神經(jīng)根縱切面。

3 討 論

有研究表明，椎間盤髓核是一種自身抗原，在暴露或纖維環(huán)損傷后，淋巴細(xì)胞會(huì)在局部椎間盤組織中聚集[5]。Kimura等[6]研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤髓核可導(dǎo)致神經(jīng)根損傷。背根神經(jīng)節(jié)是軀體感覺(jué)的初級(jí)傳入神經(jīng)元，其周圍分布著大量的痛覺(jué)感受器，當(dāng)機(jī)體組織損傷或發(fā)生炎癥時(shí)，受損細(xì)胞釋放的內(nèi)源性致痛物質(zhì)能激活痛覺(jué)感受器，或使其閾值降低。Kato等[7]報(bào)告，5-羥色胺可以使大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)可以使大鼠的下肢出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏，背根神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化[8]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1周、3周實(shí)驗(yàn)組大鼠的腰椎神經(jīng)根縱切面可見(jiàn)神經(jīng)根損傷，術(shù)后5周時(shí)其神經(jīng)根形態(tài)基本恢復(fù)正常，表明髓核組織具有自身免疫源性，顯露后可激發(fā)免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)根損傷。因此，進(jìn)一步研究免疫炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)根損傷的具體作用機(jī)制意義重大。

IL-23屬于IL-12超家族中的一員，是由P19和P40亞單位以共價(jià)二硫鍵結(jié)合組成的異二聚體分子。Oppmann等[9]于2000年首次報(bào)告IL-23是一種新的促炎癥細(xì)胞因子。近年來(lái)許多研究關(guān)注IL-23的生物學(xué)功能及其在免疫相關(guān)性疾病中的潛在治療作用，例如感染、炎癥、自身免疫和腫瘤等領(lǐng)域。Jiang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤突出癥患者的髓核組織中IL-23表達(dá)增高，且在纖維環(huán)破裂髓核組織完全暴露者中IL-23的表達(dá)進(jìn)一步增高，提示IL-23參與椎間盤突出的發(fā)病過(guò)程。IL-17是一種強(qiáng)烈的促炎癥細(xì)胞因子，主要由Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell，Treg)分泌，有極強(qiáng)大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞的能力，能誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞和刺激巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL-1、IL- 6、TNF-α、金屬蛋白酶和化學(xué)增活素等[11]。此外，IL-17與TNF-α等炎癥因子具有協(xié)同作用，可以放大并加強(qiáng)其致炎效應(yīng)[12]。IL-23主要是由活化的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，它可以誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分化成Th17/Treg，同時(shí)促進(jìn)Th17增殖并維持其存活[13-14]，此外其可促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生，且不需要γσ受體T淋巴細(xì)胞的參與[15]。因此，IL-23和IL-17通過(guò)Th17形成新的炎癥軸，在許多炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎和炎癥性腸病等[16]。Tian等[17]的研究表明，IL-17通過(guò)促進(jìn)自身免疫炎癥、趨化作用和血管生成作用參與椎間盤突出癥的發(fā)生。Cauvi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度刺激IL-23/IL-17通路可能對(duì)多菌性膿毒癥所致的肺部炎癥進(jìn)展產(chǎn)生不利影響，而恢復(fù)IL-23和IL-17表達(dá)水平之間的平衡可能有刊于敗血癥的治療。

本研究建立了非壓迫性椎間盤髓核突出大鼠模型，檢測(cè)其血清中IL-17、IL-23的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后1周、3這周時(shí)血清中IL-17、IL-23的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，右后肢疼痛縮爪閾值均低于對(duì)照組(均P<0.05)；HE染色結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后1周、3周時(shí)，神經(jīng)纖維排列不規(guī)律，大小不一，髓鞘崩解，呈空泡樣病變，炎癥細(xì)胞入侵，而對(duì)照組大鼠未見(jiàn)明顯異常。以上結(jié)果說(shuō)明 IL-17、IL-23在椎間盤髓核突出早期所致的免疫炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。在椎間盤突出早期，隱蔽的髓核組織暴露在自身免疫系統(tǒng)中，可激活免疫反應(yīng)，促使IL-17、IL-23的表達(dá)水平升高而引起免疫炎癥反應(yīng)，從而損傷神經(jīng)根，最終導(dǎo)致臨床癥狀的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后5周時(shí)，兩組大鼠的血清IL-23與IL-17的表達(dá)水平，以及右后肢疼痛縮爪閾值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且神經(jīng)根HE染色提示實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)根基本恢復(fù)正常，這可能是由于免疫系統(tǒng)具有負(fù)調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，非壓迫性椎間盤髓核突出導(dǎo)致的神經(jīng)根損傷大鼠模型血清中有IL-17、IL-23的表達(dá)水平增高，IL-23/IL-17炎癥軸在可能在根性神經(jīng)根痛發(fā)病過(guò)程起關(guān)鍵作用，其可能成為椎間盤突出癥所致腰腿痛的一個(gè)新治療靶點(diǎn)。但本研究存在一定的局限性，如未檢測(cè)神經(jīng)根中IL-17、IL-23的表達(dá)水平，也沒(méi)有進(jìn)一步研究其他細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6等)對(duì)非壓迫性椎間盤髓核突出導(dǎo)致的神經(jīng)根損傷的影響，這些細(xì)胞因子在椎間盤突出癥發(fā)病過(guò)程的作用有待研究。