UPLC-MS/MS法測(cè)定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及代謝物

尹青春 ，譚高好，鄧浩，潘永波，張容鵠，徐彬

1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所，海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（?？?570100）；2.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（?？?570100）

硝基咪唑類藥物是一類具有5-硝基咪唑環(huán)共同結(jié)構(gòu)的合成抗菌類藥物，常見(jiàn)的有甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、羥甲基甲硝咪唑等。硝基咪唑類衍生物易與生物體內(nèi)的許多大分子如酶、DNA和受體等發(fā)生超分子結(jié)合[1]，在抗癌[2-3]、祛痘[4]、抗厭氧菌[5]、抗寄生蟲[6]等方面有廣泛醫(yī)學(xué)用途。此外，使用此類藥物對(duì)動(dòng)物體重還具有增加作用[7]，因此在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛違法使用。有研究表明，硝基咪唑類藥物和其代謝物具有致突變和致癌性[8]，禽類肉和蛋制品中的硝基咪唑類藥物殘留對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成直接威脅。

我國(guó)和歐盟已將硝基咪唑類藥物列為動(dòng)物性食品不得檢出的對(duì)象。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[9]及《農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)》[10]明確規(guī)定地美硝唑、甲硝唑允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品的所有可食組織中檢出。歐盟理事會(huì)也將硝基咪唑類藥物列入A類禁用藥物，不得在任何食品中檢出[11]。但違法使用硝基咪唑類藥物現(xiàn)象屢禁不止，雞蛋等農(nóng)產(chǎn)品抽檢不合格仍時(shí)有發(fā)生。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法具有快速、高效、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，是目前檢測(cè)硝基咪唑類藥物殘留的常用方法。李小橋等[12]使用UPLC-MS/MS法測(cè)定牛肉中4種硝基咪唑類藥物殘留量。雞蛋樣品中多種硝基咪唑類藥物及其代謝物的UPLC-MS/MS批量檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。此次試驗(yàn)從提取溶劑、凈化方式、復(fù)溶液、液相流動(dòng)相、色譜柱、質(zhì)譜條件等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立UPLC-MS/MS方法，同時(shí)測(cè)定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物，為政府監(jiān)管部門提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantiva三重四極桿質(zhì)譜儀[配有電噴霧離子（ESI）源]、Ultimate 3000超高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；多管渦旋混合器（德國(guó)Heidolph公司）；Mettler XS204型十萬(wàn)分之一分析天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）；SCIENTZ-950E超聲波提取器（寧波新芝生物科技公司）。

16種硝基咪唑混標(biāo)（100 μg/mL，A ChmTek.Inc.），其它均為色譜純。雞蛋購(gòu)于?？谑行阌^(qū)秀英街道向榮村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量羥甲基甲硝咪唑、羅硝唑D3標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為100和1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液；17種混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（1.0 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取100 μg/mL 16種硝基咪唑混標(biāo)和100 μg/mL的羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)使用溶液各100 μL，用甲醇定容至10 mL。所有標(biāo)準(zhǔn)使用溶液置于-18 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 樣品前處理

將雞蛋樣品混合均勻并準(zhǔn)確稱取2.0 g，加入100 μL質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的羅硝唑D3的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，再加入10 mL 1%甲酸乙腈，漩渦10 min，超聲10 min，以10 000 r/min離心5 min；凈化：取2.0 mL上清液，加入200 mg C18，漩渦10 min，以10 000 r/min離心5 min，取1.0 mL上清液，于40 ℃氮吹干，加入1.0 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)相膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器條件

色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B，甲醇溶液；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.25 min，5% B；0.25～3 min，5% B～65% B；3～4 min，65% B～99% B；4～5 min，99% B；5～5.01 min，99% B～5% B；5.01～7 min，5% B。

質(zhì)譜：離子源ESI源，正離子模式；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式；噴霧電壓3.5 kV；汽化溫度350 ℃；離子傳輸溫度 350 ℃；鞘氣（氮?dú)猓毫?2 Arb；輔助氣（氮?dú)猓毫? Arb；碰撞氣：高純氬氣，壓力為1.5 mTorr。優(yōu)化后17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的篩選

試驗(yàn)對(duì)比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Thermo Accucore C18（2.6 μm，2.1×100 mm）和ACE Ultra Core 2.5 Super C18（2.5 μm，2.1 mm×100 mm）3種色譜柱對(duì)17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果。圖1為Waters BEH C18色譜柱的目標(biāo)化合物總離子色譜圖，其分離效果最好。劉燕等[13]在研究超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-Exactive Orbitrap）快速檢測(cè)飼料中16種硝基咪唑類藥物時(shí)也發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18色譜柱對(duì)16種硝基咪唑類藥物的檢測(cè)靈敏度及色譜峰型較好。因此選擇Waters BEH C18進(jìn)行方法研究。

圖1 目標(biāo)化合物總離子色譜圖（BEH柱）

2.2 流動(dòng)相的篩選

試驗(yàn)對(duì)比了0.1%甲酸水/甲醇、5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）/乙腈4種不同流動(dòng)相體系對(duì)17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離及響應(yīng)效果。結(jié)果表明：體系含有甲醇的流動(dòng)相對(duì)大部分硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果均較好，其中0.1%甲酸水/甲醇的色譜峰型、信號(hào)響應(yīng)、穩(wěn)定性最優(yōu)。周興鑫[14]在建立生鮮乳中250種獸殘高通量快速篩查平臺(tái)時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入0.1%的甲酸對(duì)于各化合物響應(yīng)強(qiáng)度具有明顯的提高。因此選擇0.1%甲酸水/甲醇作為體系的流動(dòng)相。

2.3 樣品提取液的篩選

分別以甲醇、乙腈、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈等11種有機(jī)溶劑作為提取液，對(duì)比17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的提取效果。結(jié)果表明：使用1%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取時(shí)，回收率為70%～130%，且1%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取效果無(wú)明顯差異，考慮到綠色環(huán)保，選擇1%甲酸乙腈作為提取液。

2.4 凈化方式的篩選

已有文獻(xiàn)報(bào)道采用Waters PRIME HLB、MCX[15]、PCX[16]、RETAIN-CX等作為凈化樣品的固相萃取柱，還有采用PSA[17-18]、MgSO4、C18或者幾種混合作為凈化樣品的吸附劑?；谝陨衔墨I(xiàn)報(bào)道，試驗(yàn)比較了MCX、HLB、PSA、C184種凈化方式的凈化效果，以加標(biāo)量為50 μg/kg的回收率為指標(biāo)，凈化效果最好的是Agela Cleanret S C18，目標(biāo)物回收率達(dá)90%～110%，其他3種凈化方式回收率浮動(dòng)較大。因此，采用200 mg Agela Cleanret S C18吸附劑進(jìn)行樣品凈化。

2.5 復(fù)溶液的選擇

取1 mL凈化后的提取液，經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s后，對(duì)比不同比例的乙腈和甲醇作為復(fù)溶液對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示：使用1%乙腈水、5%乙腈水作為復(fù)溶液時(shí)，大部分目標(biāo)物的峰型較差；使用10%甲醇水作為復(fù)溶液時(shí)，小部分目標(biāo)物的峰型不好；使用50%和80%甲醇水溶液時(shí)，各目標(biāo)物峰型較好，且均可獲得較為滿意的回收率。考慮到成本，選擇50%甲醇水溶液為復(fù)溶液。

2.6 線性范圍、檢出限、定量限、精密度

采用優(yōu)化好的UPLC-MS/MS參數(shù)進(jìn)行方法學(xué)研究，結(jié)果如表2所示。17種硝基咪唑類藥物及其代謝物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍為1.0～100 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 0，羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、噻苯噠唑、奧硝唑、阿苯噠唑亞砜、異丙硝唑、奧芬達(dá)唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、氟苯咪唑和芬苯達(dá)唑的檢出限分別為0.056，0.115，0.065，0.046，0.026，0.088，0.115，0.032，0.016，0.083，0.010，0.016，0.004，0.006，0.005，0.010和0.003 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg；SN/T 2624—2010[19]規(guī)定硝基咪唑類測(cè)定低限為1.0 μg/kg；SN/T 1626—2019[20]規(guī)定羥甲基甲硝咪唑測(cè)定低限為1.0 μg/kg，甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、奧硝唑測(cè)定低限均為0.5 μg/kg。方法的檢出限均低于標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)低限，說(shuō)明該檢測(cè)方法靈敏度較高。對(duì)質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL的17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，該方法的δRSD（n=6）為0.4%～2.3%，說(shuō)明儀器具有良好的精密度。

表2 17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的線性關(guān)系、檢出限、定量限

接表2

2.7 回收率試驗(yàn)

將17種目標(biāo)化合物添加到空白雞蛋樣品進(jìn)行50，100和250 μg/kg 3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平取6個(gè)平行樣，平均回收率為73.1%～117.7%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差δRSD為0.6%～6.5%，說(shuō)明該方法回收率及重復(fù)性較好。

2.8 樣品測(cè)定

采用試驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS方法對(duì)海南省18個(gè)市縣菜市場(chǎng)抽檢的雞蛋樣品共78批次中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的殘留量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，結(jié)果均未檢出此類獸藥。雖然，目前在抽檢的雞蛋中均未檢出17種硝基咪唑類藥物及其代謝物，但仍需加強(qiáng)此類獸藥殘留檢測(cè)的監(jiān)控。

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化分離條件和樣品提取凈化條件，建立了UPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的方法。樣品經(jīng)1%甲酸乙腈提取，經(jīng)C18吸附劑凈化，以ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱分離，0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相梯度洗脫，電噴霧正離子模式（ESI+），多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描，洛硝噠唑內(nèi)標(biāo)法定量，其他16種硝基咪唑類藥物及其代謝物外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，17種目標(biāo)化合物在1.0～100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 0，在3個(gè)不同濃度添加水平下，平均加標(biāo)回收率為73.1%～117.7%，方法δRSD為0.6%～6.5%，檢出限為0.003～0.115 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg。該方法前處理簡(jiǎn)單，具有凈化效果好、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)。測(cè)定海南省18個(gè)市縣抽檢的雞蛋樣品（共78批次），結(jié)果均未檢出此類獸藥。該方法適用于大批量雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的快速篩查、確證及定量。