高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紅心鴨蛋中紫杉紫素含量

蔡翔宇，歐玉玲，陳曉蘭，梁宇

1.南寧海關(guān)技術(shù)中心（南寧 530021）；2.桂林海關(guān)（桂林 541000）

天然紅心鴨蛋的蛋黃呈朱砂紅色，色澤穩(wěn)定、自然，在市場(chǎng)上深受消費(fèi)者喜愛。普通蛋黃的黃色色素主要由葉黃素、玉米黃質(zhì)、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)等黃色類胡蘿卜素組成[1-2]，其來源為飼料中谷物類糧食或綠色植物中的黃色類胡蘿卜素。根據(jù)有關(guān)研究[3-5]，蛋鴨通過放養(yǎng)或給飼新鮮菹草可以生產(chǎn)出天然紅心鴨蛋，天然紅心鴨蛋中含有一種名為紫杉紫素（Rhodoxanthin）的紅色類胡蘿卜素，其分子式為C40H50O2，結(jié)構(gòu)式見圖1。類胡蘿卜素對(duì)人體具有重要的生理作用[6]，研究顯示[7-11]，紫杉紫素對(duì)人體具有抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤的發(fā)生等作用。

圖1 紫杉紫素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

隨著生活水平提高，天然綠色食品的保健功能越來越受到人們的重視。因此，對(duì)天然紅心鴨蛋中紫杉紫素的研究具有重要意義。有關(guān)天然紅心鴨蛋中的紫杉紫素的檢測(cè)定量方法并未見有報(bào)道。試驗(yàn)通過利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），建立紅心鴨蛋中紫杉紫素的準(zhǔn)確定量方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜（美國AB SCIEX公司）；Nexera高效液相色譜（日本島津公司）；KQ-400DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國SIGMA公司）；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦公司）；Milli-Q Integral 10超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

紅心鴨蛋樣品去殼后，用高速組織搗碎機(jī)充分搗碎、混勻。

紫杉紫素（99.8%，瑞士Carote Nature公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；二氯甲烷（色譜純，美國TEDIA公司）；正己烷（色譜純，美國TEDIA公司）；正丙醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水（由Milli-Q Integral 10超純水機(jī)制備）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取10 mg紫杉紫素標(biāo)準(zhǔn)品分別置于100 mL容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。用時(shí)根據(jù)具體情況用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 色譜條件

采用Shim-pack XR-ODS Ⅲ（1.6 μm，2.0 mm× 75 mm）色譜柱；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.3 mL/min梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描，多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），氣簾氣（CUR）35.0 psi；碰撞氣壓Medium，霧化器（GS1）55.0 psi，輔助加熱器（GS2）50.0 psi，離子源電壓（IS）5 500 V，輔助加熱器溫度（TEM）600 ℃；其他條件見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈及5 g無水硫酸鈉后，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。對(duì)離心管中的殘?jiān)看斡?0 mL乙腈再重復(fù)提取2次，合并3次收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用5 mL乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入3 mL正己烷，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷相，下層乙腈相過0.22 μm濾膜后，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

將200 ng/mL的單標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)注射泵連續(xù)射入質(zhì)譜儀，在正模式下做一級(jí)質(zhì)譜全掃描，確定母離子。紫杉紫素相對(duì)分子質(zhì)量為562.84，故將質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為m/z510～610以排除雜質(zhì)干擾提高靈敏度。圖2為紫杉紫素的一級(jí)質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，紫杉紫素可以形成[M+H]+峰和[M+Na]+峰，但[M+Na]+峰容易受到系統(tǒng)管路、流動(dòng)相、樣品基質(zhì)的干擾而不夠穩(wěn)定，因此選擇穩(wěn)定的[M+H]+峰。對(duì)母離子施加一定的碰撞能量進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。m/z282，m/z265，m/z284和m/z246為主要的離子碎片峰，選擇豐度較高、干擾較少的2個(gè)碎片離子作為定量和定性離子，同時(shí)優(yōu)化碰撞能、去簇電壓、碰撞室入口電壓和碰撞池電壓等各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)。紫杉紫素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖見圖4。

圖2 紫杉紫素一級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 紫杉紫素二級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 紫杉紫素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

紫杉紫素屬于弱極性化合物，易被反相色譜柱保留，試驗(yàn)以甲醇-水、乙腈-水體系作為流動(dòng)相在Shim-pack XR-ODS Ⅲ（1.6 μm，2.0 mm×75 mm）上考察分離效果，結(jié)果表明以乙腈-水體作為流動(dòng)相時(shí)候能獲得較高的信號(hào)響應(yīng)值，但由于次級(jí)保留效應(yīng)使得色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，因此在水相中添加5 mmol/L乙酸銨作為改良劑，同時(shí)提高電離離子化效率。結(jié)果表明，色譜峰峰型得到明顯改善，信號(hào)響應(yīng)值也得到提高，因此選擇5 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相。

2.3 提取條件的選擇

類胡蘿卜素可溶于大部分有機(jī)溶劑中，不溶于水。參考文獻(xiàn)[12-18]，常用的類胡蘿卜素提取溶劑有二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙腈、丙酮等有機(jī)溶劑。分別用上述5種有機(jī)溶劑按照1.2.4所述方法進(jìn)行處理，在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，比較對(duì)紫杉紫素的提取效率，結(jié)果見圖5。

二氯甲烷、乙腈和丙酮均有理想的提取效率?？紤]到二氯甲烷的毒性較大，試驗(yàn)過程中容易對(duì)試驗(yàn)人員造成傷害，因此不宜大量使用。蛋黃含有大量的脂類物質(zhì)，如未有效除去，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的背景干擾并損傷色譜柱[15]，相比于丙酮，乙腈具有使蛋白變性、減少脂肪進(jìn)入提取液的特點(diǎn)，有利于后續(xù)上機(jī)分析，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖5 不同溶劑紫杉紫素提取效果的影響

2.4 線性相關(guān)性和檢測(cè)限

分別配制紫杉紫素質(zhì)量濃度為5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量5 μL，以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過逐漸降低樣品中所添加的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，化合物信噪比（S/N）3時(shí)，其質(zhì)量濃度定義為方法檢出限（LOD）。化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限結(jié)果見表3。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

選取陰性鴨蛋樣品，添加3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照1.2.4所述方法進(jìn)行前處理，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次。由表4可見，3種不同濃度水平的加標(biāo)回收率在86.7%～94.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.62%～3.45%，說明方法的回收率好、精密度高。

表4 方法的回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采集當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上銷售的10份紅心鴨蛋樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5 樣品中紫杉紫素含量

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立紅心鴨蛋中紫杉紫素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。樣品用乙腈提取后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，正己烷脫脂后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，該方法操作簡單、靈敏度高且準(zhǔn)確性好，為測(cè)定紅心鴨蛋中的紫杉紫素提供參考。