植酸及其檢測方法研究進(jìn)展

袁長梅，賀曉云，馬麗艷，周子瑩，唐小革，黃昆侖

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100083）

植酸（Phytic acid）最早是Pfeffer于1872年從糊粉谷物中發(fā)現(xiàn)的，又稱為肌醇六磷酸酯，即環(huán)己六醇的六磷酸酯（IP6），普遍存在于植物中，尤以谷物和種子中含量最為豐富[1]。植酸作為動(dòng)植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，是種子中磷的主要貯存形式，占總磷含量的50%～90%，對維持植物體內(nèi)磷的平衡有重要的作用[2]。這種分子的磷原子不能輕易被人類利用，因?yàn)槿梭w不能產(chǎn)生分解植酸的植酸酶[3]。植酸在自然界中一般不以游離態(tài)存在，主要以其與鐵、鋅、鈣、鎂等金屬離子形成的一種復(fù)鹽（俗稱菲?。┬问酱嬖赱4]。單胃動(dòng)物（人和非反芻動(dòng)物）的消化道由于沒有植酸酶而很難吸收、利用植酸鹽。一方面，這些微量元素的生物有效性大大降低，造成微量元素缺乏癥；另一方面，大量未經(jīng)吸收利用的植酸鹽隨動(dòng)物糞便的形式排出，造成土壤污染和水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題[5]。植酸鹽（Phytates）還會(huì)與蛋白質(zhì)形成難以降解的復(fù)合體，使人和動(dòng)物對蛋白質(zhì)的生物利用率降低，從而影響機(jī)體的正常代謝[6]。這種抗?fàn)I養(yǎng)作用對素食者的影響更嚴(yán)重，因?yàn)橹菜猁}在纖維膳食中的含量要高于其他膳食[7]。近年來人們對于植酸進(jìn)行深入研究，也發(fā)現(xiàn)了植酸的許多有益作用。植酸鹽因其對金屬離子較強(qiáng)的螯合能力，使之呈現(xiàn)多種重要的生理活性和保健功能，其降解產(chǎn)物大多在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用，有些還有抗癌和降血壓等活性[8]。植酸鹽是提取肌醇的最佳原料，有良好的生理作用與保健作用，可用于治療肝病等疾病[9]。鑒于其抗?fàn)I養(yǎng)作用以及生理保健功能，植酸（鹽）受到人們越來越多的關(guān)注。簡要介紹了植酸的理化特性及存在形式，重點(diǎn)研究和比較了植酸的各類檢測方法，分析其存在的問題，為未來植酸的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 植酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

植酸又稱為肌醇六磷酸，即環(huán)己六醇的六磷酸酯（InsP6），分子式為C6H18O24P6，相對分子質(zhì)量為660.08。其結(jié)構(gòu)是肌醇的6個(gè)羥基被磷酸酯化生成的肌醇衍生物，包括6個(gè)磷酸基團(tuán)和12個(gè)解離氫（圖1）。植酸分子中的12個(gè)氫解離常數(shù)（pKa）各不相同，在不同的pH條件下，植酸分子可能完全去質(zhì)子化或者部分去質(zhì)子化。Burgos-Lujan等[10]運(yùn)用核磁共振和pH滴定發(fā)現(xiàn)，在pKa1.1～2.1強(qiáng)酸性范圍內(nèi)，植酸分子中的6個(gè)氫發(fā)生解離；在pKa5.7弱酸性范圍內(nèi)，植酸分子中1個(gè)氫發(fā)生解離；在pKa6.8～7.6范圍內(nèi)，植酸分子中2個(gè)氫發(fā)生解離；在pKa10.0～12.0范圍內(nèi)，植酸分子中3個(gè)氫發(fā)生解離。這種范圍廣泛的pKa會(huì)影響植酸分子螯合金屬離子和蛋白質(zhì)分子的數(shù)量。根據(jù)不同pH條件下有多少個(gè)氫去質(zhì)子化，植酸顯示出極高的負(fù)電荷密度，具有強(qiáng)大的螯合能力，可以螯合不同個(gè)數(shù)的金屬離子，形成不同結(jié)構(gòu)的配合物[11]。

2 植酸檢測方法

植酸的檢測方法主要有直接測定法和間接測定法。直接測定法主要分為兩大類：一類是利用植酸螯合金屬離子，從而使金屬離子形成的絡(luò)合物發(fā)生褪色反應(yīng)來測量其含量，比較常見的是利用植酸和三價(jià)鐵的絡(luò)合反應(yīng)進(jìn)行定量的方法；另一類是直接從樣品中提取分離測定植酸的含量。研究表明植酸鹽在內(nèi)源植酸酶的作用下可以水解成低級(jí)肌醇磷酸鹽（InsP5、InsP4、InsP3等，見圖2），尤其對于加工食品，在一系列加工過程中，內(nèi)源植酸酶被激活，部分植酸被水解成低級(jí)肌醇磷酸鹽。InsP5已經(jīng)被證實(shí)會(huì)降低礦物質(zhì)的生物可利用性，具有4個(gè)或更少磷酸基團(tuán)，似乎對礦物質(zhì)吸收沒有任何負(fù)面影響，低級(jí)肌醇磷酸鹽降低了植酸鹽原有的抗?fàn)I養(yǎng)作用[12]。因此加工食品中植酸鹽（InsP6）的測定需要與低級(jí)肌醇磷酸鹽分離測定，才能對樣品中植酸含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。間接測定法主要分為兩大類：一類是利用植酸與其他物質(zhì)的反應(yīng)，通過測定該物質(zhì)的減少，間接測定植酸含量的方法；另一類是通過測定植酸水解產(chǎn)物中的磷或者肌醇，對植酸進(jìn)行間接定量的方法。

圖1 植酸結(jié)構(gòu)

圖2 肌醇磷酸鹽結(jié)構(gòu)

2.1 直接測定法

2.1.1 分光光度法

植酸測定的分光光度法最常見的是測鐵分光光度法，該法是以磺基水楊酸為顯色劑，磺基水楊酸與Fe3+形成紫紅色絡(luò)合物，植酸能螯合其中的Fe3+，從而使紫紅色絡(luò)合物發(fā)生褪色反應(yīng)，植酸含量與溶液褪色程度呈正比。

Carneiro等[13]利用測鐵法結(jié)合自制的泵流動(dòng)系統(tǒng)，測定了植物樣品中植酸的含量，該方法測定線性范圍在5～100 mg/L之間（對應(yīng)吸光度范圍在0.45～0.04之間），線性系數(shù)在0.999以上，最低檢出限濃度為1.0 mg/L，精密度RSD＜1%。其他研究者[14-15]同樣利用測鐵分光光度法測定了大豆、麥麩、小麥等樣品中植酸的含量，該法最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要昂貴的儀器，操作簡單易行。

Agostinho等[16]利用堿性條件下2-羥基苯胺（GBHA）與鈣離子形成紫紅色絡(luò)合物，植酸通過螯合鈣離子抑制該反應(yīng)，建立了一種簡單、靈敏的植酸測定方法。該方法得線性范圍在1.0～12.5 mg/L之間，線性系數(shù)為0.998 1，檢測限為0.33 mg/L。該方法可用于測定玉米、大豆、小麥、面粉、燕麥等樣品的植酸含量。為了進(jìn)一步拓展應(yīng)用領(lǐng)域，采用該方法對美白護(hù)膚霜中植酸含量進(jìn)行測定，其回收率在86%以上。該方法用途廣泛，精密度、準(zhǔn)確度和檢測限與文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法相當(dāng)或者更好。

Kim等[17]用[Zn3（1,3,5-三[二（吡啶-2-甲基）氨基甲基]-2,4,6-三乙基苯]]6+作為植酸受體，結(jié)合金納米粒子技術(shù)，開發(fā)了一個(gè)基于競爭的比色傳感系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)對植酸有很高的選擇性，比比色探針的檢測范圍要高100倍以上，肉眼在小于300 nm處可以很容易地檢測到植酸，并且在很寬的pH范圍內(nèi)工作良好，同時(shí)保證了高靈敏度。該方法還具有所需儀器簡單、操作簡便、便于觀察等優(yōu)點(diǎn)。

2.1.2 分子熒光法

Chen等[18]利用植酸、1,10-鄰菲咯啉和Fe3+三元絡(luò)合物形成的熒光物質(zhì)，測定了食品中的植酸含量。該方法的線性系數(shù)為0.999 4，線性范圍在0.33～32 mg/L之間，測定植酸含量4.62～24.08 mg/g的樣品，其加標(biāo)回收率在92.2%～98.3%之間。該方法簡單、靈敏，但選擇性有待提高，它為植酸的定量測定提供了新的思路。

2.1.3 高效液相色譜法

1980年Tangendjaja首次將高效液相色譜法運(yùn)用于植酸測定[1]。Burbano等[19]采用高效液相色譜法示差折光檢測器對豆類中的植酸及低磷酸肌醇進(jìn)行了分離和定量測定，樣品前處理采用了陰離子交換樹脂純化，在C18反相色譜柱上進(jìn)行分離分析。該法測定植酸對實(shí)驗(yàn)前處理的要求比較高，包括色譜柱的選擇、洗脫液的流速和洗脫條件，其靈敏度相對比較低。

Dost等[20]采用高效液相色譜法紫外檢測器測定了小麥及其制品中的植酸含量。該方法是利用植酸對Fe3+-硫氰酸鹽有色絡(luò)合物的置換反應(yīng)，利用高效液相色譜分離并監(jiān)測有色絡(luò)合物濃度的降低。硫氰酸根峰的保留時(shí)間小于3 min，方法線性范圍在10～125 μg/mL之間，線性系數(shù)為0.997，方法檢測限為0.5 μg/mL。該方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。Dost等[21]采用該法又測定了茶和堅(jiān)果類產(chǎn)品中的植酸含量，方法的線性范圍在1～150 mg/L之間，線性系數(shù)為0.993 8。果仁的測定結(jié)果在1.54～9.74 mg/g之間，綠茶的植酸含量在27.67～28.82 mg/g之間，袋裝茶的植酸含量在20.49～21.96 mg/g之間。該方法具有重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于堅(jiān)果、茶葉及其制品中植酸的常規(guī)分析。

2.1.4 離子色譜法

Talamond等[22]運(yùn)用離子色譜法分析了小米和豇豆的植酸含量，該方法的測定范圍在0.01～0.016 mmol/L之間，重復(fù)性RSD為5%（n=6），回收率為99%。同時(shí)與測鐵比色法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比色法比該法的結(jié)果高出27%。運(yùn)用該法測定谷物、油料種子、豆類的植酸含量，該法可以直接用于樣品分析，前處理更簡單，無需預(yù)純化，分析速度快，比比色法結(jié)果更為準(zhǔn)確。

Chen[23]利用離子色譜測定了豆類中的植酸和五磷酸肌醇的含量，樣品用0.5 mol/L的鹽酸提取，固相萃取柱凈化后上機(jī)。植酸測定的線性范圍在8.3～1 250 μmol/L之間，線性系數(shù)為0.999 7，回收率在94.8%～98.9%之間，檢出限為1.5 μmol/L。該方法將植酸與低磷酸肌醇分離，消除了低磷酸肌醇的干擾，定量更準(zhǔn)確。

陸智輝等[24]利用離子色譜法測定了棉仁樣品中的植酸含量，棉仁粉樣品烘干后用乙醚脫脂，稀HCl沸水浴提取，上清液純化后上樣分析。該方法的線性系數(shù)為0.999，平均回收率在98.64%～102.31%之間，檢出限為0.059 μg/mL，定量限為0.196 μg/mL。該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，缺點(diǎn)是方法前處理時(shí)間比較長。

2.1.5 電泳法

Kvasnicka等[25]采用毛細(xì)管等速電泳法對大麥及其產(chǎn)品中的植酸及低磷酸肌醇進(jìn)行了分離測定，樣品在25 min內(nèi)完成分離測定。該方法的優(yōu)點(diǎn)是分析速度快、實(shí)驗(yàn)成本低。

2.1.6 質(zhì)譜法

Zhang等[26]運(yùn)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜同時(shí)快速分離測定肌醇磷酸鹽（InsPn），利用乙酸二己銨作為離子對試劑分離肌醇磷酸鹽。該方法可以在15 min內(nèi)分離測定InsP1～I(xiàn)nsP6，線性范圍在0.3～1 200 pmol之間，最低檢出限為0.3 pmol（其中InsP2為0.15 pmol，InsP6為3 pmol），回收率在87%～111%之間，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為0.9%～15%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為2.2%～11%。該方法分析速度快，靈敏度高，同時(shí)可分離低磷酸肌醇，定量更準(zhǔn)確。

2.2 間接測定法

2.2.1 滴定法

原始的滴定法原理是利用植酸在低pH下，可以定量沉淀三價(jià)鐵，根據(jù)沉淀前后鐵含量的差異來確定樣品中植酸的含量。然而由于三價(jià)鐵和植酸的吸附量比例不是一個(gè)固定值，不同條件下變化比較大，故該方法不夠準(zhǔn)確。間接滴定法是通過定量的三價(jià)鐵和適當(dāng)?shù)呐潴w形成有色中間絡(luò)合物，植酸競爭性結(jié)合三價(jià)鐵，多余的三價(jià)鐵通過EDTA滴定測定，間接計(jì)算樣品中植酸的含量。這個(gè)中間絡(luò)合物也就是金屬指示劑，常用的有硫氰酸銨、水楊酸、水楊酸鈉、磺基水楊酸，其中磺基水楊酸最為常用。

Burgos-Lujan等[10]測定了果汁和牛奶中植酸的含量，10 mL樣品加入10 mL 0.4 mol/L稀鹽酸、10 mL 20 mmoL/L的FeCl3·6H2O溶液、10 mL 200 g/L的磺基水楊酸溶液，混合振搖，沸水浴加熱15 min，促進(jìn)植酸-鐵復(fù)合物的生成，離心后過濾，濾液用甘氨酸調(diào)整pH至2.5±0.5，運(yùn)用EDTA溶液滴定濾液，溶液從紫色變?yōu)辄S色，即為滴定終點(diǎn)。該方法測定線性范圍在10～700 mg/L之間，線性系數(shù)為0.998，檢測限為12 mg/L。該方法不能用于痕量分析。Romero-Aguilera等[12]開發(fā)了一種基于絡(luò)合滴定原理測定植酸的方法，結(jié)果用植酸當(dāng)量（PAE）來表示，其反映了樣品中植酸的絡(luò)合能力。方法的線性范圍在0.5～57 mg植酸之間，線性系數(shù)為0.998 6，最低檢出限濃度為0.02 mg PAE/100 g樣品，最低定量限為0.789 mg PAE/100 g樣品。該方法的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為2%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為4%。20 mg和40 mg植酸的添加回收率在92%～105%之間。該方法考慮到低磷酸肌醇的存在，提出了植酸當(dāng)量的概念，不需要昂貴的儀器，方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測。

2.2.2 分光光度法

植酸的分光光度間接測定法常用的是測磷法。該法主要是通過陰離子樹脂分離樣品中的植酸，然后通過酸水解消化釋放植酸中的無機(jī)磷，最后通過測定磷含量來計(jì)算植酸含量。

仲磊等[27]運(yùn)用稀鹽酸提取發(fā)芽大豆的植酸，DEAE Sepharose FF陰離子交換樹脂純化提取液，對純化溶液進(jìn)行高溫消化釋放出無機(jī)磷，最后用鉬藍(lán)比色法測定植酸中的磷含量，根據(jù)磷和植酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算出樣品中植酸含量。該方法的線性相關(guān)系數(shù)為0.999，加標(biāo)回收率為108.4%，精密度δRSD＜5%。植酸測磷法的缺點(diǎn)是樣品純化和消化步驟花費(fèi)時(shí)間比較長，不適用于大批量樣品測定。

2.2.3 電感耦合等離子體發(fā)射光譜法

因?yàn)樯攀持械闹菜峤?jīng)人體吸收后，可以從尿液中排出，在預(yù)防腎結(jié)石方面有重要的作用。Grases等[28]利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）分析了尿液中的植酸含量，樣品通過陰離子交換柱吸附分離植酸，分離后的樣品通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定磷的含量，從而推算出植酸含量。該方法的線性范圍在0～2 mg/L磷之間（0～7 mg/L植酸），檢出限為64 μg/L，定量限為213 μg/L。該方法簡便快捷，適用于普通臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)尿中植酸含量的測定。

2.2.4 質(zhì)譜法

為了驗(yàn)證組織中鈣鹽的結(jié)晶與植酸之間的關(guān)系，從而驗(yàn)證植酸預(yù)防腎結(jié)石的作用，March等[29]采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對生物樣本（大鼠器官、人血漿、尿液等）的植酸含量進(jìn)行了檢測，利用酶法將生物樣本中的植酸水解成肌醇，與衍生劑衍生后形成揮發(fā)性三烷基硅，通過氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量測定。該方法的線性范圍在18～500 μg/L之間，最低檢出限質(zhì)量濃度為9 μg/L。該法前處理過程比較復(fù)雜，目前只用于生物樣本的檢測。

Munoz等[30]運(yùn)用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）測定了人尿中的總磷含量，間接計(jì)算出植酸含量，對尿液樣本進(jìn)行簡單過濾，使用陰離子固相萃取柱純化，除去其他磷化物的干擾。該方法的線性范圍在0.02～0.06 mg/L植酸之間，方法檢出限為5 μg/L植酸含量。該方法簡單，消耗樣品量小，樣品測定速度快，是目前尿中植酸含量測定的最佳方法。

3 結(jié)語與展望

傳統(tǒng)的植酸定量檢測方法主要分為兩大類：測磷法和測鐵法。測磷法是將植酸提取轉(zhuǎn)化成磷，通過測磷的含量間接計(jì)算出植酸的含量；測鐵法是利用植酸/植酸鹽能與三價(jià)鐵定量絡(luò)合，可以直接或者間接測量植酸的含量。隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)加工食品中低級(jí)肌醇磷酸鹽的含量比較高，但是運(yùn)用傳統(tǒng)方法測定加工食品中的植酸含量時(shí)，很難將肌醇六磷酸鹽與較低取代基的肌醇磷酸鹽（InsP5、InsP4、InsP3等）分離開來，結(jié)果不夠準(zhǔn)確，容易使結(jié)果偏高。傳統(tǒng)分析方法靈敏度低，分離低級(jí)肌醇磷酸鹽的能力有限，因此有必要尋求更精確的替代方法，如高效液相色譜法、離子色譜法、質(zhì)譜法等，但是這些方法需要貴重的儀器設(shè)備、復(fù)雜的前處理過程，會(huì)導(dǎo)致植酸的降解，對于未加工的食品是否同樣適用，這些都是需要深入探討的問題。

根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域的不同，所介紹的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但理想的方法尚未達(dá)成一致。樣品的前處理過程長短導(dǎo)致的植酸鹽的分解、樣品的種類差異導(dǎo)致的肌醇磷酸鹽種類的差異等都是未來方法需要重點(diǎn)關(guān)注的問題。