基于二氧化硫含量及聚類分析的芡實(shí)比較

蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（蘇州 215008）

芡實(shí)，為睡蓮科植物芡（Semen euryales）的干燥成熟果仁，主要分布于亞熱帶和溫帶地區(qū)，是藥食同源材料。作為藥食同源中藥材，采用硫磺熏蒸這樣一種常用的中藥材粗加工方法，雖然可以使藥材迅速干燥，便于儲(chǔ)存，具有漂白、防蟲，防止發(fā)霉、生菌，但若過(guò)量熏蒸則會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害[1-4]。硫熏后的藥材會(huì)對(duì)藥材中有些活性成分含量降低，需要嚴(yán)格控制二氧化硫殘留量[5-7]。因此，二氧化硫殘留是芡實(shí)食品安全中的重要問(wèn)題。

二氧化硫的測(cè)定主要有酸蒸餾碘滴定法[8]、酸堿滴定法[9]、氣相色譜法[10-12]、離子色譜法[13-18]、電化學(xué)分析法[19-22]等，碘滴定法和酸堿滴定法是中藥材中常用的測(cè)定方法，碘滴定法在2015版藥典后改為酸堿滴定法[23]。芡實(shí)中二氧化硫殘留測(cè)定研究較少，通過(guò)酸蒸餾-酸堿滴定方法測(cè)定芡實(shí)中二氧化硫的殘留量[24]，有助于為嚴(yán)格控制芡實(shí)的安全性和有效性提供依據(jù)。

聚類分析是依據(jù)觀察對(duì)象某些特征加以歸類的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[25]，被廣泛應(yīng)用于食品藥品成分分析。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

STEHDB-106-1智能一體化蒸餾儀（濟(jì)南盛泰電子科技有限公司）；500 mL兩頸圓底燒瓶；10 mL堿式滴定管；碘量瓶；BT124S-CW型電子天平（德國(guó)賽多利斯）。

1.2 試藥

氫氧化鈉、鹽酸、30%過(guò)氧化氫、乙醇、甲基紅試劑（分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；高純氮?dú)猓兌却笥?9.99%）；已知SO2濃度質(zhì)控樣（批號(hào)18-05，0.59 g/kg）。

1.3 樣品

芡實(shí)購(gòu)買于各地超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 試劑配制

2.1.1.1 甲基紅乙醇試劑（2.5 mg/mL）

精密稱取25.0 mg甲基紅試劑置于10 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。

表1 芡實(shí)來(lái)源

2.1.1.2 3%過(guò)氧化氫溶液

精密量取10 mL 30%過(guò)氧化氫溶液置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.1.3 6 mol/L鹽酸溶液

取54 mL鹽酸置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 滴定液的配制及標(biāo)定

2.1.2.1 氫氧化鈉滴定液的配制

取適量氫氧化鈉，置聚乙烯塑料瓶中，加水振搖溶解使其飽和溶液，冷卻后，離心，上清液備用。

2.1.2.2 氫氧化鈉滴定液的標(biāo)定

精密稱取6 g在105 ℃干燥至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，加50 mL新沸過(guò)的蒸餾冷水，振搖，使其盡量溶解，加2滴酚酞指示液，用2.1.2.1的上清液進(jìn)行滴定，接近終點(diǎn)時(shí)，應(yīng)使鄰苯二甲酸氫鉀完全溶解，滴定至溶液顯粉紅色，每1 mL氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）相當(dāng)于20.42 g鄰苯二甲酸氫鉀，根據(jù)溶液消耗的量與鄰苯二甲酸氫鉀取樣量，推算出溶液濃度。

實(shí)際標(biāo)定的氫氧化鈉濃度C（NaOH）=0.098 28 mol/L。

2.2 測(cè)定原理

在密閉的蒸餾瓶中加入6 mol/L鹽酸將其酸化，樣品中二亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化為二氧化硫，通過(guò)氮?dú)獯氲胶须p氧水的吸收瓶中，雙氧水將其氧化為硫酸根離子，利用酚酞作為指示劑，在酸性條件下為粉紅色，因此利用氫氧化鈉進(jìn)行滴定，溶液變?yōu)辄S色，來(lái)判斷滴定的終點(diǎn)，利用氫氧化鈉的體積消耗量從而計(jì)算芡實(shí)中的二氧化硫含量。芡實(shí)中二氧化硫含量[23]按式（1）計(jì)算。

式中：V為供試品溶液消耗氫氧化鈉滴定液體積，mL；V0為空白溶液消耗氫氧化鈉滴定液體積，mL；C為氫氧化鈉滴定液濃度，mol/L；32.03為1 mL氫氧化鈉滴定液（1.0 mol/L）相當(dāng)于二氧化硫質(zhì)量，g；m為樣品稱樣量，g。

2.3 空白溶液的制備

取250 mL蒸餾水溶液置于500 mL兩頸圓底燒瓶中，加10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，置于STEHDB-106-1智能一體化蒸餾儀中，通入氮?dú)馔瑫r(shí)將氮?dú)饬髁空{(diào)節(jié)至0.2 L/min（保證二氧化硫均勻流出），打開冷凝裝置，冷凝管的出口處連接一橡膠導(dǎo)氣管置于250 mL錐形瓶中，錐形瓶?jī)?nèi)加入50 mL 3%過(guò)氧化氫溶液作為吸收液，在吸收液中加入3滴甲基紅乙醇溶液指示劑，并用0.01 mol/L氫氧化鈉滴定液至黃色，打開加熱裝置，使兩頸瓶?jī)?nèi)溶液至沸，保持微沸1.5 h后，停止加熱，吸收液冷卻后，用氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）滴定至溶液顯黃色，且黃色持續(xù)時(shí)間20 s不褪色，根據(jù)鹽酸的變化來(lái)判斷滴定終點(diǎn)，記錄氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）消耗的體積，作為空白溶液消耗量。

2.4 供試品溶液的制備

取湖南岳陽(yáng)產(chǎn)的芡實(shí)，粉碎，過(guò)二號(hào)篩，精密稱取10.0 g置于500 mL兩頸圓底燒瓶中，加250 mL水和10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，置于STEHDB-106-1智能一體化蒸餾儀中，通入氮?dú)馔瑫r(shí)將氮?dú)饬髁空{(diào)節(jié)至0.2 L/min（保證二氧化硫均勻流出），打開冷凝裝置，冷凝管的出口處連接一橡膠導(dǎo)氣管置于250 mL錐形瓶中，錐形瓶?jī)?nèi)加入50 mL 3%過(guò)氧化氫溶液作為吸收液，在吸收液中加入3滴甲基紅乙醇溶液指示劑，并用0.01 mol/L氫氧化鈉滴定液至黃色，打開加熱裝置，使兩頸瓶?jī)?nèi)溶液至沸，保持微沸1.5 h后，停止加熱，吸收液冷卻后，用氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）滴定至溶液顯黃色，且黃色持續(xù)時(shí)間20 s不褪色，根據(jù)鹽酸的變化來(lái)判斷滴定終點(diǎn)，記錄氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）消耗體積，利用式（1）計(jì)算出芡實(shí)中二氧化硫含量。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取湖南岳陽(yáng)產(chǎn)的芡實(shí)，粉碎，過(guò)二號(hào)篩，按照2.4的方法平行制備6份供試品，按照2.2的滴定原理進(jìn)行滴定，記錄3%過(guò)氧化氫吸收液所消耗的氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）的體積來(lái)計(jì)算，測(cè)定結(jié)果。

測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%之內(nèi)，表明方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性考察試驗(yàn)

取湖南岳陽(yáng)產(chǎn)的芡實(shí)，粉碎，過(guò)二號(hào)篩，按照2.4的方法平行制備7份供試品，按照2.4的方法操作進(jìn)行測(cè)定，分別在0，2，4，8，16，20和24 h記錄吸收液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）體積，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

結(jié)果見表3，δRSD為1.94%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 芡實(shí)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取湖南岳陽(yáng)產(chǎn)的芡實(shí)，粉碎，過(guò)二號(hào)篩，稱密稱取6份芡實(shí)，按照2.4的方法制備供試品，每份5.0 g，另精密稱取20 mg已知SO2濃度的質(zhì)控樣品（1 g含二氧化硫0.59 mg），6份，分別加入上述樣品中，進(jìn)行滴定測(cè)定，記錄吸收液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）的體積，同時(shí)做空白試驗(yàn)，計(jì)算加樣回收率。

加樣回收率試驗(yàn)的平均回收率為86.21%，δRSD為3.89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%之內(nèi)，符合中國(guó)藥典四部藥品分析方法學(xué)中回收率的要求。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定

取28批不同產(chǎn)地的芡實(shí)，粉碎后，精密稱取10 g，每批平行制備2份，按照2.4的樣品溶液的方法制備，進(jìn)行測(cè)定。

樣品含量測(cè)定結(jié)果見表5，結(jié)果表明不同產(chǎn)地芡實(shí)樣品中二氧化硫含量相差很大。

表5 28批芡實(shí)樣品中二氧化硫測(cè)定的結(jié)果

2.9 聚類分析

對(duì)28個(gè)不同產(chǎn)地的芡實(shí)中的二氧化硫含量進(jìn)系統(tǒng)聚類分析，采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件，組間聯(lián)接方法，平均Euclidean距離，進(jìn)行層次聚類，平均Euclidean距離為5時(shí)，28批次芡實(shí)藥材樣品共分為三大類，見圖1。其中，2號(hào)（福建寧德）、11號(hào)（江蘇高郵）、8號(hào)（江蘇蘇州）、7號(hào)（江西上饒）、12號(hào)（江蘇揚(yáng)州）、24號(hào)（云南麗江）、10號(hào)（江蘇興化）、19號(hào)（廣西桂林）、9號(hào)（江蘇徐州）、18號(hào)（貴州銅仁）、1號(hào)（湖南岳陽(yáng)）、3號(hào)（福建莆田）為第一類；15號(hào)（湖南益陽(yáng)）、17號(hào)（四川中江）、13號(hào)（安徽安慶）、27號(hào)（山東棗莊），28號(hào)（山東臨沂）、14號(hào)（安徽蕪湖）、16號(hào)（四川成都）、25號(hào)（廣東揭陽(yáng)）、6號(hào)（廣東潮州）、22號(hào)（遼寧沈陽(yáng)）、23號(hào)（遼寧鐵嶺）、26號(hào)（廣東江門）、4號(hào)（廣東湛江）為第二類；20號(hào)（河北安國(guó)）、21號(hào)（遼寧遼陽(yáng)）、5號(hào)（廣東肇慶）為第三類。由系統(tǒng)聚類分析可以看出同類之間的二氧化硫含量結(jié)果相似度較高，比如第三類中20號(hào)（河北安國(guó)）、21號(hào)（遼寧遼陽(yáng)）、5號(hào)（廣東肇慶）這3個(gè)產(chǎn)地中的二氧化硫含量均高于150 mg/kg，二氧化硫超標(biāo)，因此在食用時(shí)應(yīng)引起注意，同時(shí)食品藥品監(jiān)督管理部門應(yīng)關(guān)注，從而保證芡實(shí)食用安全性。

圖1 28批次芡實(shí)藥材中二氧化硫含量的聚類分析

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定28個(gè)不同產(chǎn)地批次的芡實(shí)中二氧化硫含量，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相差很大，可能與當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)環(huán)境氣候有關(guān)。中國(guó)藥典對(duì)山藥、天麻、天花粉、白芍、粉葛、牛膝等藥材中二氧化硫的限量標(biāo)準(zhǔn)主要是300 mg/kg，除另有規(guī)定外中藥材及飲片中二氧化硫不得過(guò)150 mg/kg，不同國(guó)家的限量值也不同，韓國(guó)為二氧化硫不得過(guò)30 mg/kg，日本為二氧化硫不得過(guò)50 mg/kg，美國(guó)為二氧化硫不得過(guò)50 mg/kg，WHO為二氧化硫不得過(guò)150 mg/kg，食品中對(duì)于蔬菜干中（包括種子、堅(jiān)果等）的限量值為500 mg/kg，由于芡實(shí)屬于藥食同源的藥材。

結(jié)果表明，如果以中藥材的標(biāo)準(zhǔn)判斷，測(cè)定的28個(gè)不同產(chǎn)地批次的芡實(shí)3個(gè)產(chǎn)地批次的樣品不合格，不合格率為10.7%；如果以食品干果限量判斷，則全部合格；如果出口到韓國(guó)，則不合格率為60.7%；出口到日本和美國(guó)，則不合格率為53.6%，因此二氧化硫?qū)τ谲蛯?shí)藥材的安全性和出口具有一定限制。

不同產(chǎn)地芡實(shí)都檢出含有二氧化硫，硫磺熏蒸是一種傳統(tǒng)的中藥材加工方法，應(yīng)用比較廣泛，解決硫熏的難題，需要從種植源頭抓起，在原料生產(chǎn)、流通、銷售過(guò)程中隨時(shí)監(jiān)管、隨時(shí)監(jiān)控，而且要通過(guò)大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)，制定合理限度范圍，提高原料安全性和有效性。